摘要
生长因子具有肝脏生理学和病理学的关键作用，特别是通过促进细胞增殖和生长。最近，已经表明，在小鼠肝细胞中，表皮生长因子受体（EGFR）在通过抗癫痫药物苯甲虫生物脂肪酸蛋白酶传感体系组成的androstane受体（汽车）的激活中起着至关重要的作用。由于汽车信号传导的物种选择性，在这里，我们研究了在原发性人肝细胞中的汽车信号传导中的表皮生长因子（EGF）作用。将原发性人肝细胞与Citco，人载体激动剂或苯巴比妥，间接车激活剂一起温育，在存在或不存在EGF的情况下。在编码轿厢和PXR的基因的沉默基因中评估了依赖于载体的基因表达调制和PXR参与这些反应。EGF显着降低了诸如苯巴比妥的Citco的汽车表达和预防基因诱导，并且在更低的程度上通过苯酚产生。在没有EGF的情况下，Phenobarbital和Citco分别在原发性人肝细胞中分别调节144和111个基因的表达。在这些基因中，仅由Citco和苯巴比妥调节15，以依赖于汽车的方式调节15。相反，在EGF，CitCo和苯巴比妥的基因表达仅以独立于汽车和依赖性方式调节基因表达。总体而言，我们的研究结果表明，在原发性人肝肝细胞中，EGF主要通过转录调节抑制特定车辆信号，并将异卵反应朝向妊娠X受体（PXR）介导的机制驱动。
介绍
肝脏是一种代谢活性器官，其基本上通过肝细胞的代谢功能基本上生物转化多种外源性和内源化合物。这些活动被协调的转录因子网络精细调节。其中，已知两种核受体控制关键解毒酶的表达：妊娠X受体（NR1I2）和组成型androstane受体（CAR，NR1I3）（Wang et al.， 2012）.它们也可能参与癌症的发展和耐药性(De Mattia et al.， 2016）.此外，越来越多的证据表明它们调节许多内源性信号和串扰，所述信号通路涉及胆汁酸，脂质，激素，葡萄糖，炎症，维生素和其他内生物学的稳态（瓦格纳等人，2005年；Pascussi等人，2008年；Wada等，2009年）.PXR活化可能使脂肪变性，肥胖和胰岛素抵抗恶化（周等，2006，2008；李等，2012）.相反，轿车激活通常被描述为有益，因为它允许维持胆固醇和胆汁酸的稳态，降低血糖和脂肪变性。然而，在人的原发性肝细胞中没有对脂质代谢的汽车效应（Lynch等人，2014年）.
考虑到汽车和PXR在转化异种菌和调节细胞代谢中的核心作用，很多研究都集中在鉴定和开发分子来调节其活动。然而，PXR和汽车功能的研究受到了几个因素的阻碍。实际上，通过识别普通响应元件的汽车和PXR之间的串扰触发了协调肝反应的重叠靶基因的互核激活（谢等，2000）.例如,CYP2B6是人类汽车的目标，但也可以通过利福平（RIF），特异性PXR活化剂有效诱导（Goodwin等，2001年）.同样的汽车可以调节CYP3A4，原型PXR靶基因（Maglich等，2002年）.此外，CAR和PXR作为异源二聚体与视黄X受体(RXR, NR2B1)共同作用，并共享共激活因子，如SRC-1和PGC-1α，以及辅阻遏因子，如SMRT和NCoR (Oladimeji et al.， 2016）.因此，识别人类特异性功能和靶基因是挑战性的。
已发现特异性特异性直接车激动剂，例如6-（4-氯苯基）咪唑[2,1-B] [1,3]噻唑-5-碳甲醛O-(3,4-二氯苯)肟(CITCO) (Maglich等，2003年)和1,4-二-[2-(3,5-二氯吡啶氧基)]苯，3,3 '，5,5 ' -四氯-1,4-二(吡啶氧基)苯(TCBOBOP) (Tzameli等人，2000年)用于鼠标CAR。相反，苯巴比托(PB)是一种间接的CAR激活剂，不直接与CAR配体结合域相互作用，因此不显示物种特异性。孕烯醇酮16α-丙烯腈特异性地激活小鼠PXR，而抗生素RIF激活人类而不是小鼠PXR。人的PXR也可以被PB通过受体结合机制激活，与PB介导的CAR激活的受体结合独立机制不同(Moore等人。，2000）.PB激活CAR是啮齿动物肝癌发生的关键分子启动事件。铅对人体没有致癌作用的报告(欢迎combe等人，2014年）.
积累证据表明，在肝再生和癌症期间抑制了异种症代谢。这种刺激对生长因子和细胞因子的参与的调查，因为它们在肝脏再生和疾病中的重要作用是重要作用（Berasain和Avila, 2014年）.例如，EGF抑制CYP2B.PB诱导小鼠和大鼠肝细胞基因表达(河村等，1999；Koike等人，2007年）.此外,EGF-mediatedCYP2B6对人肝细胞的抑制伴随着强烈的车mRNA表达（巴希达等人，2009年）.最近发现的CAR和EGFR之间的串扰(Mutoh等人。，2013年）进一步突出细胞增殖/存活和肝脏排毒/代谢之间的连接。早期和最近的研究表明，PB通过预防EGFR磷酸化来激活汽车转录活动（Mutoh et al.， 2009；Negishi，2017年）.最近，发现EGF刺激汽车同态化，从而在其非活动形式迫使汽车（Shizu等人。，2017年）.实际上，CAR配体(CITCO)和间接活化剂(PB)的CAR活化是通过同型二聚体-单体转换调控的(Shizu等人。，2017年）.此外，PB与EGF竞争，用于在人细胞系和小鼠肝细胞中与EGFR结合（Mutoh等人。，2013年）.
迄今为止，EGF对原代人肝细胞(PHHs)中CAR信号转导的影响尚未被研究。该模型比人肝细胞系具有优势，如转录因子和共调节分子的生理表达和人CAR在细胞质中的定位。我们使用人CAR激动剂CITCO和人CAR间接激活剂PB，研究了EGF对PHHs中CAR转录活性的影响。我们还用特定的sirna下调CAR以识别特定的靶标/反应。我们发现EGF如预期的那样降低了CAR靶基因的转录，也降低了CAR，但没有降低PXR的表达。EGF显著影响PHH对直接(CITCO)或间接(PB)激活剂的应答，并阻止car依赖的基因表达。最后，我们证明了在EGF存在的情况下，CAR的靶基因不是由PB通过CAR调控的，而是通过PXR调控的。
材料和方法
原发性人类肝细胞分离和培养。
PHHs由Biopredic International (Rennes，法国)提供或分离，如前所述(Pichard等人，2006年），来自供体的器官不适合移植或来自成人患者在成人患者中进行的肝脏切除，以获得与我们的研究计划无关的医疗原因。肝脏样品是从蒙彼利耶大学医院的生物资源中心获得的（CRB-Chum;http://www.chu-montpellier.fr；Biobank ID：BB-0033-00031），这项研究受益于Jeanne Ramos博士（HepatogastroEntology Collection）和Sylvain Lehmann教授（CRB-Chum Manager）的专业知识。患者的临床特征介绍表1．该手术由法国伦理委员会批准，并获得患者或其家属的书面或口头同意。
PHHs在confluent (4.105细胞/孔）在胶原蛋白涂层的24孔菜和5％CO中的培养2在37℃的湿化气氛中培养肝细胞(WME培养基中添加5µg / ml胰岛素，0.1µM氢化鞘，10µg / ml转铁蛋白,250年µg/ml抗坏血酸、3.75 mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白、2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素)。当提示时，肝细胞生长培养基中添加10 ng/ml EGF (Peprotech, Neuilly-Sur-Seine, France) (Ismail等人，1991年；Katsura等，2002）.
siRNA转染。
粘附PHHs用10 nM扰乱siRNA (siCT)或ON-TARGET + SMARTpool sinas(四种人专用sinas池)转染NR1I3(编码CAR的基因)或人类NR1I2（编码PXR的基因）（Dharmacon，Lafayette，CO）在播种后第2天和第5天使用Lipofectamine Rnaimax（Life Technologies，Carlsbad，CA）。在第5天后，PHHS与0.5毫米PB，1孵育µM提交10µM RIF (Sigma, St. Louis, MO)或vehicle(二甲基亚砜)24小时。
RNA分离和定量PCR。
使用Trizol试剂（Invitrogen / Life Technologies）提取RNA，然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒（应用生物系统，CA），然后使用300ng的总RNA逆转录（RT）。使用roche syber绿色试剂和轻循环480设备（Roche Diagnostic，Meylan，法国）进行定量PCR（QPCR）：在95℃下一步10分钟，然后在95°C下变性50个循环10秒钟，在65℃下退火15秒，并在72℃下伸长15秒。引物序列列于表2.．
微阵列数据采集。
扩增总RNA (500 ng)，在GeneChip HT HG-U133+ PM阵列板上标记杂交。根据制造商的说明(Affymetrix, High Wycombe, UK)获取数据。对于每个条件，采用5个生物重复。利用Affymetrix GCOS 1.4软件对扫描板进行处理，利用算法的鲁棒多芯片平均(Robust Multichip Average, RMA)实现对Affymetrix CEL文件进行归一化，得到强度值信号。cel文件中的原始微阵列数据可在基因表达文集中获得，登录号为GSE68493http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/．
微阵列数据分析。
使用Web工具Genomicscape（Genomicscape.com）分析了微阵列数据（Kassambara等人，2015年）.简单地说，使用S.D.最高的15000个探针组对微阵列进行配对显著性分析。显著性使用Wilcoxon检验和显著失调基因(fold change, FC， >1.3;错误发现率<5%)。维恩图是使用Venny工具生成的(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）.利用聚类3.0和Treeview制作了已鉴定的感兴趣基因的热图。最后，利用KEGG[京都基因和基因组百科全书(KEGG)]和STRING网络工具(http://string-db.org.）.
蛋白质分析。
使用补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）的RIPA裂解缓冲液从PHH培养物中提取总蛋白质。根据制造商的说明（Pierce Chemical，Rockford，IL），使用双链烷基酸法测定蛋白质浓度。蛋白质（20.μ在10％预制SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Bio-rad Laboratories，Marnes La Coquette，法国）上分解了G /样品）并转移到聚偏二氟乙烯膜（Bio-rad Laboratories）。将膜与抗CYP2B6和GAPDH（SC-67224和SC-32233; Santa Cruz Biotechnology）一起温育。用辣根过氧化物酶 - 共轭小鼠二抗（Sigma）检测免疫复合，然后增强化学发光（Millipore，Molsheim，France）。使用ChemIdoc-XRS +设备（Bio-Rad Laboratories）获得信号，并用图像实验室软件量化（版本4.1）
Digiwest。
采用NuPAGE SDS-PAGE凝胶系统(Life Technologies)进行蛋白分离和印迹。蛋白质(18μ根据厂家说明书，使用4%-12%的Bis-Tris凝胶进行分离。在标准条件下对PVDF膜(Millipore)进行印迹。对于高含量Western blot分析，采用DigiWest方法(Treindl等人，2016年）.
统计分析。
定量PCR结果以均数±S.E.M.表示t测试。在以下情况下，差异被认为具有统计学意义P< 0.05。
结果
EGF强烈影响PHHs的基因表达。
首先，用10 ng/ml EGF长期孵育(从第0天到第5天)，监测PHHs中EGFR通路的活性。ERK1/2(在T202和Y204)、MEK1/2(在S217和S221)和直接下游激酶RSK1 (p90RSK T573)的磷酸化证实了与配体孵育后EGFR通路的持续激活(图。1A）.
与EGF孵育后PHHs的差异基因表达。(A)蛋白在PHHs (Liv10，表1)，用10 ng/ml EGF孵育5天。(B) egf处理的PHHs中上调基因和富集通路的数量[错误发现率(FDR) = 4.7 × 10−18-1.9×10−5］．(C) egf处理的PHHs中下调基因和富集途径的数量(FDR = 8.8 × 10)−10-0.008)。(D)显示PHHs中差异表达基因的热图(n= 5)与EGF孵育后。
然后，在孵育的PHHS中进行全局转录组分析，其在同一时期（第0天至第5天）孵育的pHH。与对照PHHS（不含EGF）相比，在EGF处理的培养物中解毒328个基因（187个上调和下调141）。Kegg途径富集分析显示差异表达基因对特定生物过程的贡献。在EGF孵育后上调的基因主要是在14kegg途径中分类，主要与细胞增殖和癌症相关（Komposch和Sibilia，2015年）（图。1B）.相反，与EGF孵育时下调的基因主要属于代谢相关的KEGG通路。“亚博体育app药物代谢细胞色素P450”和“细胞色素P450对外源性药物的代谢”是5个最受调控的信号级联(图1C.）.对最显著解除调控的基因(35个上调基因和35个下调基因)的无监督层次聚类清楚地表明，尽管个体间存在变异，但PHH样本根据是否与EGF孵育而分离(图。1D）.NR1I3(星号图。1D)来编码CAR，它是人类的主要调节器CYP2B6在EGF孵育后下调的基因中(FC = 0.31, q = 0.009)。
EGF减少了汽车和轿车靶基因的表达。
为了确定EGF在轿厢的作用和PHHS中的信号传导中，将细胞与Citco，轿厢激动剂或Pb，间接车激活物，在存在或不存在下（从第2天至第3天后3天后）温育24小时10 ng / ml EGF。Citco以低浓度使用，不会激活PXR（Maglich等，2003年）.为了排除由于长期处理引起的间接效应，在（第0天）或伴随（第2天）之前加入EGF与活化剂。RT-QPCR分析证实，与未处理的细胞（UT）相比，EGF特异性和可重复地降低的汽车mRNA水平（图2A），在Citco和Pb的存在或不存在，但对PXR mRNA表达（未示出）进行了微小的影响。接下来，因为PB可以激活汽车和PXR（莱曼等人，1998年；Moore等人。，2000)，它们的原型靶基因的表达CYP2B6（Sueyoshi等人，1999年),CYP3A4被监控。在没有EGF的情况下，PB和CITCO孵育增加CYP2B6和CYP3A4mRNA水平与UT细胞相比。相反，在强烈而显着减少汽车激活剂之前或之前与EGF孵育或孵育CYP2B6CITCO及PB上调(图。2B)和CYP3A4，并在较低程度上由PB (图2C.）.注意，CYP2B6基础水平（UT样品）也受培养基中的EGF存在的显着影响（图。2B）.
EGF特别影响CAR及其靶基因在PHHs中的表达。来自两个捐赠者(Liv1和Liv2，表1)与1µM CITCO, 0.5 mM PB，或二甲基亚砜(DMSO) (UT)，在没有或存在10 ng/ml EGF的情况下24小时。EGF于诱导物[0 (D0)]前或[2 (D2)]同时加入。相对表达车(一),CYP2B6(B)CYP3A4(C)通过qPCR检测mRNA，归一化为RPLP0．在不含EGF的培养基中，结果相对于对照(UT)表达;＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P<0.01，相对于同一治疗组的对照（无EGF）;＃P< 0.05;＃＃P< 0.01，相对于对照组(UT)。
这些发现表明，EGF通过调节其表达和可能的活性，快速和更具体地靶向CAR信号在PHHs中。
EGF通过汽车影响CYP2B6感应。
为了更好地理解EGF对CAR信号的影响，我们使用特异性小干扰rna (siCAR)和非靶向siRNA作为阴性对照(siCT)下调了CAR的表达。在第2天和第5天转染siRNA后，车独立于EGF孵育(从第1天到第5天)和第5天添加CITCO或PB孵育24小时后，mRNA表达降低约50% (图3A）.与此同时，CAR抑制减弱CYP2B6基本表达由两倍(图3B.)，如表皮生长因子(图。2B）.在没有EGF的情况下，CYP2B6在SICT细胞中分别在Citco和PB孵育后诱导〜15-和〜17倍。在汽车耗尽的PHHS中，这种诱导减少了50％以上（图3B.， 剩下）。在EGF的存在下，废除了汽车下调CYP2B6Citco介导的mRNA诱导，而它没有显着影响Pb诱导（图3B.尽管EGF的存在受到很大影响CYP2B6mRNA水平。CYP2B6表达的Western印迹分析证实了这些结果（图3C.）.在PHHs与CITCO和PB孵育后观察到的不同效果以及CAR下调的影响，提示EGF通过CAR影响CYP2B6的诱导。
汽车耗尽抑制CYP2B6只有在没有EGF的情况下，由PB和CITCO诱导。来自5个供体(Liv3-7)的PHHs用对照(siCT)或CAR-targeting sinas (siCAR)转染。然后用0.5 mM PB和1µM Citco或DMSO（UT）24小时，有或没有10ng / ml EGF（来自D0）。相对表达车（a）和CYP2B26.(B) qPCR检测mRNA，归一化为RPLP0．结果在没有EGF的sict转染细胞中相对于UT表达。(C) Western blotting检测CYP2B6蛋白水平(以Liv12中的PHHs为代表实验)。以GAPDH蛋白表达量作为负载对照。在不含EGF的培养基中，结果相对于对照(UT)表达;***P< 0.005，相对于对照组(siCT);# # #P< 0.005，相对于对照组(UT)。
EGF差异地影响对CITCO和PB的响应。
我们之前的观察仅限于CYP2B6这是典型的CAR靶基因。因此，我们通过转录组学分析来评估EGF对PHHs中CAR转录活性的影响。首先，为了确定受EGF影响的基因，我们分析了在EGF存在或不存在的情况下，sict转染的PHHs与CITCO或PB孵卵的转录组谱(图4,A和B）.独立于EGF存在/不存在，在与PB孵育而不是与Citco一起进行更多的基因（No EGF：144与111;分别与EGF：109与58）同意，与PB脂肪效应相一致（Handschin和Meyer, 2003年）.此外，在EGF存在的情况下，大多数基因对PB或CITCO的反应是上调的(红色)，而在EGF不存在的情况下，这种效应是异质性的(上调和下调)。进一步的分析只揭示了这一点CYP2B6和CYP2A6(CITCO孵育后所有解除调控基因的1.2%)在EGF存在和不存在的情况下，CITCO均显著解除调控(图4A）.然而，在EGF的存在和不存在下，Fc值不同（Fc = 2.1与10.5CYP2B6，FC = 1.4 vs. 14.8CYP2A6）.另一方面，在PB孵育时，45个基因（21.6％的所有病毒基因，包括CYP2A6和CYP2B6)在EGF不存在和存在时均受到影响(图4B.)， EGF对其FC的影响较弱(数据未显示)。功能特征显示，109个基因中大部分只有在EGF编码的药物代谢酶缺失的情况下才被CITCO解除调控，并与外生代谢过程相关(表3）.在不依赖EGF的45个pb去调控基因中也观察到了类似的模式(表4.）.令人惊讶的是，在只有EGF存在的PB(64个基因)或CITCO(56个基因)解除调控的基因中，许多基因与mRNA加工有关。此外，在EGF缺失的情况下，大多数对PB反应的失调基因与脂质和类固醇代谢有关。
EGF对CITCO和PB的反应有不同的影响。维恩图显示了5个供体(Liv3-7)在与1µM CITCO (A)或0.5 mM PB (B)在无或存在10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下。在每个实验条件下，上调和下调基因的数量分别用红色和绿色表示。
最后，比较转染了sict的PHHs与PB (图5A)或CITCO (图5B.）在没有EGF（相对于UT细胞）的24小时显示，在没有EGF的情况下，大多数富集的途径属于代谢，无论治疗如何。通过PB培养的培养物中的EGF弱影响了这种概况。相反，在EGF的存在下，与任何富集的KEGG途径不相关。
相对于未处理的细胞，来自5个供体(Liv3-7)的sict转染的PHHs与0.5 mM PB (A)或1µ在有或没有10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，M CITCO (B)处理24小时。
CAR靶向基因的鉴定。
然后在与花氟氯胞菌或Pb（有或没有EGF）孵育后基因诱导的作用在通过SICAR转染下调的PHHS中。在与SICAR细胞中对Citco或Pb的对Citco或Pb的反应性的基础，鉴定了一份汽车靶基因列表（表5.）.在siCT细胞中EGF缺失时，CITCO解除调控的111个基因中(图4A)，只有15个基因被鉴定为car靶向基因。它们包括先前描述的CAR目标(Cyp2b6， -2a6/7， -2c8/9, 3a4/7/43, epx1, alas1，和p)及四个新潜力(RDH16, TSKU，CPEB3)及下调管制(TAGLN）基因（表5.）.在无EGF的siCT细胞中PB诱导的144个基因中(图4B.）， 最多 （n= 140）以独立于汽车的方式调节。在PB治疗的PHHS中的少数汽车靶标中，CYP2B6和CYP2A6/7也由Citco诱导，而STEAP2PB特异性下调。
在EGF的存在下，仅在SICT细胞中的Citco治疗后解毒的58个基因中，CYP2B6和CYP2A6由CITCO以依赖car的方式进行监管。相反，在EGF存在下与PB孵育时，没有基因以car依赖的方式被调控(表5.）.
这些结果通过qPCR进行了验证。在siCT细胞中,CYP2A6和CYP2A7（图6,A和B)在无EGF的情况下，PB和CITCO同样诱导。这种诱导在CAR下调(siCAR)后被强烈抑制。在EGF存在的情况下，诱导CYP2A6和CYP2A7通过Citco和PB在SICT细胞中强烈减少。抵押轿厢下调后，Citco介导的诱导，而PB介导的诱导受影响较小，如图所示CYP2B6（图3B.）.在没有EGF的情况下，CYP3A4，CYP3A43，CYP3A7，CYP2C8，CYP2C9、TSKU EPHX1， 和p（图6,C-J；表5.）Citco依赖于汽车表达的上调，而大多数Pb诱导的基因是汽车独立的，但对于CYP2C8和TSKU．通过sicar介导的对citco诱导反应的抑制程度监测，CAR的贡献在基因之间存在差异，并与EGF对基因表达的抑制作用呈正相关。在对照组(siCT)和car - depletion细胞中，添加EGF并没有改变PB对这些基因的FC诱导。相反，EGF完全消除了CITCO对这些基因诱导的影响(图6中,有氯），如图所示CYP2B6（图3B.）.这种模式没有被观察到CPEB3和STEAP2（图6,M和N）.这些结果表明EGF对PHHs的药物代谢反应有深刻的影响。亚博体育app
来自两个捐赠者(Liv6和Liv7，表1)用对照(siCT)或CAR-targeting sirna (siCAR)转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在是否存在10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。相对表达CYP2A6(一),CYP2A7(B),CYP3A4(C),CYP3A43(D),CYP3A7(E),CYP2C8(F),CYP2C9（G），TSKU(H),EPHX1（一世），p（j），alas1.（k），TAGLN(左),STEAP2(M)CEBP3.(N) mRNA通过qPCR检测，归一化为RPLP0．结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P< 0.01，相对于同一治疗组的对照组;＃＃P<0.01;# # #P< 0.005，相对于对照组(UT)。
分析EGF对PHH转录组的影响，突出了与无EGF培养的重要差异。由于CAR的表达受到EGF的抑制，因此在EGF存在的情况下，CITCO的作用是不存在的。令人惊讶的是，在EGF存在下，PHHs与CITCO孵卵时，仍有58个基因上调(图4A)，其中55个基因也被PB解除了调控(图4B.）.
完全pHH转录组分析表明，1）EGF强烈影响异索传感器汽车的转录活性，2）PHH对Pb的响应对EGF的敏感性远低于Citco，这表明涉及独立于汽车独立机制。
在EGF存在下，PXR调控CAR靶基因。
众所周知，PXR分享配体和靶基因与人类的汽车（Moore等人。，2000）.最近，坎德尔等人(2016)利用人肝细胞证明，CAR和PXR分别被CITCO和RIF激活，解除了相同的途径(包括药物代谢途径)。亚博体育app我们的结果表明，EGF对CAR的表达有负面影响，在siCAR细胞中，PB仍然可以诱导一组基因。因此，我们假设在EGF存在的情况下，PXR可以代替CAR。为了验证这一假设，在EGF存在或不存在的情况下，我们评估了sirna介导的PXR (siPXR)下调后，CITCO和PB在PHHs中的作用。在sippxr转染的PHHs中，降低了50%PXR观察到MRNA，独立于PB，CITCO或EGF的存在（图7A）.汽车mRNA水平没有受到影响（图7B.）.与在siCAR细胞中观察到的不同，在没有EGF、PB-和citco介导的情况下CYP2B6PXR下调不抑制诱导(图7C.）.相反，在EGF存在时，pb介导CYP2B6PXR下调显著降低诱导，而citco介导的诱导不受影响。CYP3A4只有在EGF缺失的情况下，CITCO才上调mRNA (无花果2 b。和7 d；表5.)，无论EGF是否存在，PB诱导均依赖于PXR。这些数据表明，在EGF存在的情况下，PB对CYP2B6和CYP3A4表达可以通过PXR而不是CAR介导。这被sirna介导的CAR和PXR下调证实(图7e.）.实际上，在EGF存在下，诱导Cyp2b6， -3a4， -2c8， -2a6， -2a7， -3a43， 和TSKUPB (图7F.）在下调PXR（但不是轿车）表达时受到强烈降低的。此外，这种效果在电池中增加，其中汽车和PXR沉默，特别是CYP2A6和CYP2A7．
来自5个捐献者的PHHs (Liv3-7，表1)用对照(siCT)、CAR-targeting (siCAR)或PXR-targeting (siPXR) sirna转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。相对表达PXR(一),车(B),CYP2B6（c），或CYP3A4(D)用qPCR法检测mRNA，归一化为RPLP0．结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。来自LIV16的PHHS用SICT，SICAR和/或SIPXR SIRNA转染。然后，将它们与0.5mM Pb或DMSO一起温育24小时，在10ng / ml EGF（来自DO）的存在下。相对表达车和PXR(E),CYP2B6，CYP3A4，TSKU，CYP2C8，CYP2A6，CYP2A7，CYP3A43（f）通过QPCR测量mRNA并标准化为RPLP0表达水平。结果是相对于未治疗的培养基（白色棒）的培养基中未治疗的SICT转染的PHHS表示。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P<0.01;***P<0.001相对于同一治疗组中的控制。
最后，在用于基因表达分析的不同PHH培养物中，个人分析Citco或Pb（在没有EGF的情况下）的影响（n= 8)表明citco介导的诱导CYP2B6不同样本的mRNA表达是不同的(图8A）.此外，在Liv13和Liv15中，它显著低于PB介导的作用，Liv14相对于UT几乎没有诱导作用。同样，不同培养物中相对的CAR mRNA水平比PXR的异质性更大(分别从1到100和1到10，未显示)。比较8个样本的CITCO效应和PXR/CAR mRNA表达率，发现在EGF缺失时，PXR/CAR mRNA表达率较低(图8B.)(例如,高车MRNA表达），Citco介导CYP2B6诱导率高(图8A）.相反，当PXR/CAR mRNA比例高(即低)时车MRNA表达），Citco介导CYP2B6感应很低。在EGF下调CAR表达的情况下，CYP2B6诱导在与花旗孵育比PB孵育后较低（图8C.），PXR / CarmRNA比值（低慢型）（图8D）.此外，SiRNA介导的汽车或PXR下调在两种样本中，其对CITCO不佳（LIV13和LIV15）表示CYP2B6PB依赖于PXR活动的上调（图8，E和F.)，不论表皮生长因子是否存在。
来自八个捐助者的PHHS（LIV3-7和13-15，表10.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。相对表达CYP2B6通过qpcr测量并标准化为RPLP0在(A)或(C) EGF存在的情况下。无EGF(以LOG10表示)或有EGF(以LOG10表示)时PXR/CAR mRNA的表达比例。来自两个捐赠者(Liv13和Liv15，表1）（E和F）用对照（SICT），靶标（SICAR）或PXR靶向（SIPXR）siRNA转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。相对表达CYP2B6通过qpcr测量并标准化为RPLP0在EGF缺失或存在的情况下。结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P<0.01;***P<0.001。
总之，当汽车表达低并且在EGF存在下时，观察到从汽车到PB-靶基因诱导的PB-靶基因诱导的切换。这种观察可能对目标疗法的发展至关重要。
讨论
生长因子在肝脏生理中起着至关重要的作用，一些生长因子参与CAR的活性和表达已经被广泛研究。然而，关于EGF在PHHs中的作用的数据很少。在这里，通过使用直接和间接的CAR激活剂，我们证明了EGF影响的表达车和CYP2B6，原型汽车靶基因，pHHS。然后我们发现很少有基因严格依赖于PHHS。此外，在该细胞模型中，间接轿厢活化剂PB在差异或存在EGF的情况下差异地调节基因表达，但主要以互相独立的和PXR依赖性方式调节。这可能影响药物调查研究的设计和解释。
很少有研究分析体外人CAR激活后的PHH转录组谱。坎德尔等人(2016)对核受体CAR、PXR和PPAR的诱导转录组进行了全基因组比较α在收购phh (坎德尔等人，2016年）.Li et al. (2015)研究了全基因组的亲代和HepaRG细胞的转录组谱NR1I3被撞倒(CAR-KO)令人惊讶的是，在111个受CITCO差异调控的基因中，我们只发现了15个CAR靶基因，在144个受PB影响的基因中，我们只发现了4个CAR靶基因。相反,Li et al. (2015)发现在HepaRG细胞中，135个基因和120多个基因的表达分别受到CITCO和PB的影响，并以car依赖的方式(李等人，2015）.解除调控基因数量的差异可能与细胞类型有关(HepaRG细胞vs. PHHs)。此外，通过siRNA沉默CAR只导致大约50%的下降车PHHS中的mRNA表达。因此，我们不能排除剩余的轿车蛋白足以调节基因表达，并且我们只确定了主要的汽车目标。但是，观察到CYP2B6CITCO治疗后，car -贫肝细胞的表达显著下调，表明沉默策略是有效的。此外，已报道PB和CITCO脱靶效应(上田等人，2002年；李等人，2015）.因此，我们的结果符合PB非特异性和磷酸性效应以及其可能的PXR横向激活，并突出了较差的独立式CITCO活动。
最先前描述的大多数鉴定的汽车靶基因（Alas1, por, cyp2a6 -2a7 -2b6 -2c8 -2c9 -3a4 -3a7, ephx1）（坎德尔等人，2016年)，仅发现4个新基因，其中3个经PCR验证(TSKU，TAGLN，RDH16）.CYP2B6，CYP2A6， 和CYP2A7是唯一被PB和CITCO以car依赖性方式调控的基因。CYP2A6和CYP2A7位于附近的CYP2B6在19Q13.2的染色体上，可以涉及常用调制机制。因此，几项研究发现了CYP2A6（Maglich等，2003年；Itoh等人，2006年),CYP2A7（坎德尔等人，2016年)是由CITCO在PHHs中诱导的。TSKU是由PB在HepaRG细胞和PHHs (Lambert et al.， 2009）并由PXR在成骨细胞中调节（Ichikawa等，2006）.TAGLN,本研究中发现的一个被CAR下调的新基因，其编码的transgelin主要在星状细胞和成纤维细胞中表达(Petkov等人，2004年）.我们不能排除PHHs可能被非实质细胞污染。视黄醇脱氢酶16 (RDH16）参与视黄醇合成。它的表达在PPAR后增加了αPHHs的活化(坎德尔等人，2016年）.在硅分析中，发现其调控区域存在推定的DR3和DR4基元，表明CAR (Ebert等人，2016年）.我们的结果表明，在PHHs中，只有极少数基因是严格依赖CAR的，这表明互补机制可以促进外源性相关基因的表达。这可以部分解释人类和老鼠之间的差异。使用体内和体外方法研究CAR在啮齿类动物中的转录调节，可以帮助理解我们的发现是否针对PHHs，还是2D培养模型的偏见。事实上，基因表达(Lauschke等，2016b)及能量代谢(Fu et al.， 2013当在培养中接种人/啮齿动物肝细胞时，模式迅速改变。因此，虽然PHHS是人类研究中最相关的细胞模型，但使用该系统的体外数据应该谨慎地解释。在过去十年中，已经开发了在体内情况下模仿的细胞文化策略。特别是肝细胞已在3D球状体中培养（巴赫曼等人，2015年；贝尔等人，2016年；Vorrink等人，2017年)，不论是否存在基质细胞(Khetani和Bhatia, 2008年）和中媒体（Vinci等。，2011年；Lin et al.， 2015；Lauschke等，2016a）.转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析表明，这些条件有利于长期维持细胞活力和体内类肝表型。与2D培养条件相比，这一过程中I期和II期酶、III期转运体、异种受体(CAR和PXR)和转录因子(HNF4)的稳定表达，以及细胞间接触、胆管结构和活性的改善。因此，从单层细胞转移到三维细胞培养系统可以大大提高核受体的表达和基因介导的调控(Vorrink等人，2017年）以及对药物代谢和毒性的体外评估（亚博体育appLin and Khetani, 2016）.
有研究表明，在EGF2B转基因小鼠的肝脏中，诱发恶性肿瘤的基因表达增加，而与视黄酸和外源性代谢相关的酶表达下调(Borlak等人，2005年）.有趣的是，我们在PHHs中得到了类似的结果。KEGG通路分析显示，在EGF存在的情况下，上调的基因大多属于细胞周期和癌变通路(Komposch和Sibilia，2015年）.此外，在EGF存在时，与药物代谢-细胞色素P450相关的通路下调(亚博体育app图1C.）.这些通路在CAR-KO HepaRG细胞中也下调(李等人。2015)，提示egf介导的表型可以被解释，至少部分可以被CAR信号放松(李等人，2015）.该假设通过该假设加强了同样的Kegg途径在与Citco孵育的PHHS中上调[本研究和坎德尔等人(2016)］．由于EGF的存在，这种citco介导的效应几乎完全消失(图5B.）.
在我们的模型中，我们观察到EGF也有类似的影响CYP2B6CITCO和PB短期培养诱导(第2天)(图2）.此外，在EGF存在的情况下培养6天后，由citco介导CYP2B6与PB介导的诱导相反(图3）.我们的转录组分析清楚地揭示了使用CITCO作为激活剂时EGF对CAR信号传导的强大作用。相比之下，PB反应几乎不受EGF的影响。这与PB的非特异性作用是一致的，但也提示了一种次级代偿机制。
汽车活动调节涉及多种机制，包括AMPK，胰岛素，EGFR和MEK-ERK信号传导途径（Yang and Wang, 2014；Yasujima等人，2016年）.相反，对CAR转录调节的研究很少。促进肝再生的肝营养因子部分通过核因子降低人肝细胞P450酶活性κB激活和汽车下调（Dayoub等人，2006年）.在小鼠HGF过表达的小鼠模型中，CAR而不是PXR mRNA表达减少(Kakizaki等人，2007）.评估其他生长因子和/或血清是否在PHHs和HepaRG细胞中具有类似的抑制作用是很重要的(Aninat等，2006）.此外，在HepG2细胞中，EGF和血清下调了CAR的表达，而PXR和视黄X受体的表达没有下调(Osabe等人，2009年)，通过SAPK信号通路。这也可能发生在PHHs中。
HNF-4.α, PGC-1α，糖皮质激素受体被认为是汽车启动子活动的主要调节因子（Pascussi等人，2003年；丁等，2006）.胰岛素样生长因子-1受体抑制剂(李等，2012)和甲状腺激素(Ooe等，2009年)也可以调节CAR的表达。此外，miR-34-a (Lamba等人，2014年）和mir-137（Chen et al.， 2014） 导致NR1I3downregulation。HNF4α调节CAR的转录活性(冈萨雷斯,2008)和表达(丁等，2006；Kamiyama等人，2007）.然而,HNF4α基因表达在我们的模型中不受EGF的影响。直接HNF4α磷酸化是肝细胞中EGF作用的另一种可能机制(de boussac等人。，2010年；Vető等，2017）.
重要的是，我们发现在EGF的存在下，汽车不再调节其靶基因的表达（但是对于CYP2B6和体内CYP2A6基因表现,在较低程度上)。利用基因沉默策略，我们可以证明PB优先诱导CYP2B6通过选择性的CAR激活，但当CAR的数量有限时(在EGF存在和CAR被人为下调时)，可以切换到PXR激活。研究发现，在EGF存在的情况下，许多由PB独立于CAR调控的基因是已知的PXR靶基因(例如，Cyp2b6、cyp3a7、cyp2c8、cyp3a4、ephx1、cyp3a43、cyp2c9、thrsp、alas1、abcc2、por、cyp3a5， 和ABCB1)进一步支持pxr介导的补偿机制的存在，可能允许克服对潜在威胁缺乏反应。这一结论与在CAR- ko HepaRG细胞中观察到的在没有CAR竞争的情况下人类PXR的作用增强相一致(李等人，2015）还有不对称的调节CYP3A4和CYP2B6通过汽车或PXR先前报道Faucette等人(2006)．我们还观察到药物代谢酶的诱导取决于PXR / CAR比率。亚博体育app类似地，在鼠标中使用报告基因的先前报告显示了PXR / CAR比率的至关重要的作用Cyp2b10调制（Ding和Staudinger, 2005年）.考虑到CAR和PXR表达的个体间差异，这一观察结果可能对药物开发产生关键影响。
完全，我们的调查结果将新的见解对eGF对PHHS中的汽车活动作用的影响，这可能是生理相关的，并突出了汽车生物学中转录规则的重要性。汽车转录调节可能在药物代谢和运输，能量稳态和细胞增殖中发挥低估的作用。亚博体育app此外，与啮齿动物中描述的结果不同，我们的作品表明，间接车激活剂Pb主要以独立于汽车的方式调节基因表达，尽管EGF显着影响对该药物的PHH响应。评估使用最近的微流体和3D球形培养系统来评估这种效果是有趣的，其中保持核受体表达（Lauschke等，2016a；Vorrink等人，2017年）.最后，CAR和PXR在CAR耗尽细胞中基因调控的切换突出了EGF存在下这些异种传感器之间的串扰。这种相声提供了一种机制，放大身体对各种化学物质的解毒反应。
除了在药物代谢中发挥主要作用外，CAR和PXR也是治疗癌症的潜在药理靶点(亚博体育appDe Mattia et al.， 2016）和代谢疾病，如胆汁淤积，非酒精脂肪肝疾病和糖尿病（Kakizaki等人，2007；高和谢，2012）.由于PXR和CAR可能不同地影响代谢途径，因此选择性地靶向这些受体是很重要的。在这种情况下，控制用于研究CAR活性的肝细胞的微环境和培养条件是至关重要的。
致谢
我们感谢A. Kassambara提供的生物信息学建议，感谢E. Vidal和F. Carol提供的技术支持。这项工作得益于蒙彼利埃大学医院中心(CHU)的转录组设备和该设施的科学经理Véronique Pantesco (v-pantesco@chumontpellier.fr)的专业知识。
作者贡献
进行实验:de Bousssac, Gondeau, Briolotti, Duret, Treindl, Römer, Templin, gerbal - chalin。
贡献了新的试剂和分析工具：法布尔，埃雷罗，拉莫斯，莫雷尔。
执行数据分析：De Bousssac，Gerbal-Chaloin，Daujat-Chavanieu。
手稿的写的或对手稿的写作有贡献的:De Bousssac，Gerbal-Chaloin，Daujat-Chavanieu。
脚注
- 已收到2017年9月19日。
- 接受2017年12月14日。
根据资助协议n°115001 (MARCAR项目)，导致这些结果的研究获得了创新医学计划联合事业(IMI JU)的资助。
↵1S.G.-C。和M.D.-C。合著者。
缩写
- 车
- 组成型和甾烷受体
- CITCO
- (6) - 4-chlorophenyl咪唑并[2,1 b] [1,3] thiazole-5-carbaldehydeO- (3 4-dichlorobenzyl)肟
- CYP.
- 细胞色素P450.
- 表皮生长因子
- 表皮生长因子
- 表皮生长因子受体
- 表皮生长因子受体
- 足球俱乐部
- 褶皱变化
- KEGG
- 基因和基因组的京都百科全书
- PB.
- 苯巴比妥
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- ph
- 主要人类肝细胞
- qPCR
- 定量聚合酶链反应
- PXR
- 孕烷X受体
- RIF
- 利福平
- UT
- 未经处理的
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![Differential gene expression in PHHs following incubation with EGF. (A) DIGIWest analysis of protein expression in PHHs (Liv10, Table 1) following incubation or not with 10 ng/ml EGF for 5 days. (B) Number of upregulated genes and enriched pathways in EGF-treated PHHs [false discovery rate (FDR) = 4.7 × 10−18–1.9 × 10−5]. (C) Number of downregulated genes and enriched pathways in EGF-treated PHHs (FDR = 8.8 × 10−10–0.008). (D) Heat map showing the genes differentially expressed in PHHs (n = 5) following incubation with EGF.](http://www.3tejia.com/content/dmd/46/3/223/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
![EGF influences specifically the expression of CAR and its target genes in PHHs. PHHs from two donors (Liv1 and Liv2, Table 1) were incubated with 1 µM CITCO, 0.5 mM PB, or dimethylsulfoxide (DMSO) (UT) for 24 hours in the absence or presence of 10 ng/ml EGF. EGF was added before [day 0 (D0)] or together [day 2 (D2)] with the inducers. The relative expression of CAR (A), CYP2B6 (B), and CYP3A4 (C) mRNA was measured by qPCR and normalized to RPLP0. Results are expressed relative to control (UT) in medium without EGF; *P < 0.05; **P < 0.01, relative to control (no EGF) in the same treatment group; #P < 0.05; ##P < 0.01, relative to control (UT).](http://www.3tejia.com/content/dmd/46/3/223/F2.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
