摘要
Volanesorsen（以前称为ISIS 304801）是部分地有20个核苷酸的2'-O- （2-甲氧基乙基）（2'-MOE）修饰的反义寡核苷酸（ASO）缺口基体，这是最近在欧盟批准作为一种新型的，先入级待遇甘油三酯水平的患者减少家族性乳糜微粒血症综合征。我们的特点的吸收，分布，代谢，并在小鼠，大鼠，猴子和人类volanesorsen排泄的特性，在任何放射性标记或nonradiolabeled研究。这也包括所有在尿液排出体外观察到的ASO代谢物物种的表征。Volanesorsen高度必然是在小鼠，猴子和人类相似的血浆蛋白。在所有物种中，血浆浓度在多相方式下降，其特征在于，相对快速的初始分布相，然后慢得多的末端消除相皮下推注给药。volanesorsen的血浆代谢物分布是跨物种相似，volanesorsen作为主要组分。各种寡核苷酸缩短代谢物（5-19个核苷酸长）在多剂量小鼠和猴研究组织进行鉴定，但在[更少3.H]-volanesorsen大鼠研究，可能是由于在大鼠单剂量代谢产物积累较低。在尿液中，观察到组织中发现的所有代谢物，与内切核酶和外切核酶介导的代谢一致，尿液排泄是volanesorsen及其代谢物的主要排泄途径。
意义的声明利用新颖的提取和定量技术在临床前毒理学研究收集的样品，我们表征了吸收，分布，代谢，和volanesorsen的排泄（ADME），部分2'-MOE修饰的反义寡核苷酸，从小鼠到人，一个3.^ h大鼠ADME研究，第一阶段临床试验。
介绍
罕见的遗传疾病一直是传统小分子药物治疗的一个挑战。由于反义寡核苷酸(ASOs)在RNA水平上的独特作用机制(Bennett和Swayze, 2010年)。杂交的ASO到其目标互补的mRNA，它们可以通过RNA酶H活性改变RNA降解剪接或结果的位点，从而调节蛋白的翻译或消除毒性RNA（克鲁克，1999年,2004年)。在药物化学的发展导致已作出改善在艾滋病服务的药代动力学和药效学特性（若干化学修饰瓦格纳,1994;Altmann等人，1996;利马等人，1997年;马诺哈兰，1999年)。在各种不同的修改，对磷酸二酯骨架结构和硫代磷酸酯修饰的2'-O核糖部分的-(2-甲氧基)(2 ' - moe)修饰一致证明具有更强的代谢稳定性和与目标mRNA更高的结合亲和力，同时通过嵌合设计策略保持RNase H活性，并降低一般非杂交毒性(马诺哈兰，1999年;麦凯等。，1999年;Danis等。，2001年;宇等。，2007年;基尔，2009年)。这些2 ' -MOE修改通常被称为第二代ASOs。2-methoxyethyl修改导致有效的发展,药物活性,具体ASOs如mipomersen(销售Kynamro)、载脂蛋白B - 100合成的抑制剂用于降低低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、总胆固醇、纯合子家族性高胆固醇血症患者和非高密度脂蛋白胆固醇(Kastelein等人，2006年），以及inotersen（市售为TEGSEDI），肝转甲状腺素蛋白生产蛋白的抑制剂用于减少组织血清转甲状腺素蛋白和运甲状腺素蛋白沉积物的风险患者的神经病引起的遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性（Ackermann等人，2016;Benson等人。，2018;申和科里，2018年)。
Volanesorsen，一个20个核苷酸的部分2'-MOE修饰的ASO缺口聚物，被开发用于抑制载脂蛋白C-III（APOC3），甘油三酯和富含甘油三酯的脂蛋白的代谢的关键角色。编码APOC3的基因的过表达与高甘油三酯血症有关，而在APOC3丧失功能的突变与低甘油三酯水平相关联，并且对于心血管疾病的风险降低（Graham等人，2013年;杨等人。年，2016年)。过表达APOC3的患者甘油三酯水平可能高于约1000 mg/dl，并增加胰腺炎的风险(Schmitz and Gouni-Berthold, 2018年)。治疗volanesorsen导致在这两个APOC3生产和甘油三酯浓度强大的减少（Pechlaner等人，2017年)，最近被欧盟批准为降低家族性乳糜血综合征患者甘油三酯水平的一种新的、一流的治疗方法。volanesorsen的药代动力学和代谢特性已经在从小鼠到人的不同物种中得到了彻底的鉴定，包括作为毒理学研究一部分的小鼠和猴子的代谢，在使用放射性标记材料的大鼠，以及在一项1期健康志愿者研究中的人类。这些研究的结果是描述和比较跨物种。此外，所有ASO代谢物的肾排泄也有报道。此编译代表了部分2 ' - moe修饰ASO的完整代谢剖面。
材料和方法
试验化合物
Volanesorsen（也称ISIS 304801，ISIS，载脂蛋白CIIIRX和IONIS，载脂蛋白CIIIRX)是一种20碱基硫代磷酸寡核苷酸，在未修饰的DNA寡核苷酸间隙(图。1)。[通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）测定的]的试验化合物的全长纯度结果91.1％用与N-1（缺失序列）相关联的杂质1.6％。给药是基于全长20-mer的寡核苷酸的量来执行。放射性标记的volanesorsen制成（AM化学LLC，CA）用结合到所述寡核苷酸的所述翼部的脱氧胸苷核苷酸之一的核糖的非交换性5-碳位置（氚图1）在大鼠放射性处置和质量平衡的研究。的电波的化学纯度[3.H] -volanesorsen为97.1和比活度为1956年μCI /毫克。
序列和volanesorsen的结构，在位置1-5和15-20 2'-MOE修饰硫代磷酸酯反义寡核苷酸（加下划线的）。所有胞嘧啶分别为5甲基化和3.标号H置于在核糖C-5位的胸腺嘧啶（用星号标记）。
毒理学研究在小鼠，大鼠和猴子
所有动物研究使用的机构动物护理和使用委员会批准的方案和方法进行，并按照指南的关怀和实验动物的使用进行了通过，并经卫生美国国家研究院（贝塞斯达，MD）颁布。雄性和雌性CD-1小鼠（Charles River Laboratories公司，威尔明顿，MA）在亚慢性都使用和慢性研究（26周26周恢复的剂量的（6或13周13周恢复的剂量）的)。Volanesorsen在任一3,30通过皮下注射来施用，或100mg / kg给药，每隔一天，共四剂（负载方案），随后每周给药持续6周;4，12，40或100mg / kg给药，每隔一天，共四剂（负载方案），随后每周一次给药13周和一个13周的恢复期为亚慢性研究;或3，10，30，或80毫克/公斤给药达三个剂量（负载方案），随后每周一次给药26周用26周的恢复期为慢性研究每三天。代谢在选定的样品包括：1）从接收动物的峰值和从亚慢性研究波谷血浆样品（在第42天至7天给药后分别在第42天，1次小时给药后）进行了研究30 mg / kg剂量;2)tissues from the subchronic study, including both liver and kidney samples from day 44 to day 93 [i.e., approximately 48 hours after the doses on days 42 and 91, respectively, with a subset of tissues from day 93 also being used for the mass spectrometry (MS) identification study] from animals that received a 12 mg/kg dose and day 182, 13 weeks after the last dose, from animals that were dosed with 100 mg/kg; and 3) urine from the chronic study from 0 to 24 hours and 24–48 hours postdose on day 175 from animals that received the 80 mg/kg dose.
雄性和雌性SD大鼠（Charles River Laboratories公司），在2年的致癌性研究中使用。Volanesorsen在0.2,1或5mg / kg的每周一次通过皮下注射给药达92天。等离子体药代动力学参数进行了研究用于在给药的最后一天（92天）所有剂量水平。
雄性和雌性食蟹猴（食蟹猴;塞拉利昂生物医学动物群体，火花，NV）在这两个亚慢性和慢性研究中使用的是在小鼠的研究完成。Volanesorsen在4，8，12或40mg / kg给药，每隔一天或者通过皮下注射来施用，共四剂（负载方案，不同之处在于前三个负荷剂量为4,8和12毫克/千克给药的动物是通过1小时静脉内输注），随后每周一次给药13周的亚慢性研究;或3，6，12，或20毫克/千克在第1天，第4和7 1周（加载方案）中，随后每周一次给药达39周的慢性研究。米etabolism was studied in selected samples including: 1) peak and trough plasma samples from the subchronic study [2 hours postdose on day 91 and predose on day 91 (i.e., 7 days postdose on day 84) from animals that received the 8 mg/kg dose]; 2) tissues from the subchronic study including both liver and kidney cortex samples collected on days 44, 93, and 182 (i.e., approximately 48 hours after the dose on day 42, day 91, or 13 weeks after the dose on day 91 from animals that received the 12 mg/kg dose, with a subset of tissues from day 93 also being used for the MS identification study); and 3) urine from the chronic study from 0 to 24 hours and 24–48 hours postdose on day 252 from animals that received the 20 mg/kg dose.
大鼠的吸收、分布、代谢和排泄研究3.H] -Volanesorsen
在雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories, Inc.)中研究了单剂量[3.H] -volanesorsen经由皮下注射在两个5和25毫克/公斤，相当于100和500μ分别Ci /公斤。药代动力学、组织分布和质量平衡样本均取自给予5 mg/kg单次皮下剂量的动物[3.H] -volanesorsen，而定量全身放射自显影和附加代谢物谱和鉴定样品来自与给予单独的25mg / kg的单次皮下剂量的动物[3.H] -volanesorsen。
人体的药代动力学和代谢
在健康男性志愿者1期临床研究（ISIS 304801-CS1）（年龄28-52岁，体重公斤56.4和110.4之间具有21.1和29.6公斤/ m之间的身体质量指数2,n= 4每个处理组，并随机三种活性：一个安慰剂，除了n= 4活性为400毫克多剂量群组1天）涉及任一单次皮下注射在50，100，200，或400毫克，或在50多次皮下注射（总共六个），100，200，或400毫克上的第一周期间交替的天数（天1，3和5），然后每周一次，接下来的3周（天8，图15，和22）。米etabolism was evaluated in patients who received multiple administrations at 400 mg and included: both peak and trough plasma samples [4 hours postdose on days 22 and 29 (i.e., approximately 7 days postdose on day 22)], and urine samples collected from 0 to 24 hours postdose after the first (day 1) and last (day 22). All subjects provided their written, informed consent. The study protocol was approved by a central institutional review board (Institutional Review Board Services, Canada) and performed in compliance with the standards of good clinical practice and the Declaration of Helsinki in its revised edition.
分析方法
杂交酶联免疫吸附试验。
用定量、灵敏的杂交酶联免疫吸附法(ELISA)测定血药浓度Yu等人。（2002年）。简单地说，是volanesorsen(5 ' -)互补序列的杂交ATAAAGCTGGACAAGAAGCT-3 '，锁定的核酸修饰)，包含生物素在5 '端和地高辛在3 '端，与血浆中存在的volanesorsen，随后与杂交复合物固定在neutravidin涂层板。然后加入S1核酸酶来裂解任何未杂交的检测探针。在加入与碱性磷酸酶结合的抗地高辛(antidigoxigenin)催化AttoPhos (Promega, Madison, WI)转化形成荧光产物后，对附着在平板上的杂化复合物进行测量。加入15% Na，反应停止2HPO4·7H2O，然后使用荧光板读出器测量荧光强度。测定的校准范围是1.0-100纳克/毫升用于限定定量的下限的母体化合物，具有该范围的低端（1.0纳克/毫升）。样品有10,000最大稀释到适合的校准范围。该测定小鼠，大鼠，猴和人血浆样品的分析之前进行了验证为精度，准确度，选择性，灵敏度和定量volanesorsen的稳定性。合成的具有缩短的推定的寡核苷酸代谢物标准显示没有可测量的交叉反应性，这证实了测定的父寡核苷酸特异性进行了测定。
蛋白质结合分析。
超滤法（渡边等，2006）被用于测定血浆蛋白volanesorsen的结合程度。来自小鼠，猴和人新鲜血浆被用于评估蛋白质在两种浓度（5和150的结合μ克/毫升）的括号C最大预期超过临床前和临床研究中评估的剂量范围。整除(50μ超滤液（含有未结合的volanesorsen）和初始血浆样品的每等分升）[含有总（结合和未结合的）volanesorsen]使用相同的核酸酶依赖性杂交ELISA法先前描述的进行测定。然后，未结合的volanesorsen的百分比测定（浓度超滤液通过初始血浆浓度分频），由此计算结合volanesorsen的百分比。所有样品在最小的1稀释成的混合人血浆：用于ELISA的适当的运行4和最样品稀释大于1：4装配到校准范围。
代谢物鉴定使用LC-MS / MS。
所选择的血浆，组织，尿等来自小鼠，猴和人的研究样品，提取并分析以类似的方式如先前报道（Yu等人2016)。简单地说，所有样品先均匀并有内标ISIS 355868（5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT-3'，一个27聚体硫代磷酸酯2'-MOE提取之前加入部分修饰的寡核苷酸，其中2'-MOE修饰的寡核苷酸用下划线标出）。提取过程是通过首先进行用苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）一液 - 液萃取完成后，接着使用96孔地层X填充板通过固相萃取（Phenomonex公司，CA)。样品通过蛋白沉淀板（Phenomonex公司）有一个附加的次前的洗脱物在50在氮气下干燥向下℃。样品用140重构μ含有100升水μ摩尔EDTA。
样本分析了离子对质与安捷伦1100 LC / MS / MS系统(安捷伦科技,威尔明顿),加载的流动相组成的乙腈25% 25毫米醋酸tributylammonium (TBAA), pH值7.0,第一次被注入到装载列(宽孔隙C18警卫队列,4×2.0毫米;然后回流，用XBridge柱(50 mm×2.1 mm, 2.5)分离寡核苷酸μm粒径，200a孔径;水域,米尔福德,MA)。用27%乙腈在5 mM TBAA中平衡，pH 7.0，维持在55℃，流量0.3 ml/min。样品首先通过光电二极管阵列检测器，在260 nm处采集紫外吸光度，然后串联质谱测量。设置单四极质谱仪扫描质量-电荷比窗口为900-1900，喷雾电压为4 kV，鞘气流量为35 psig，干燥气体流量为12 l/min，温度为335℃，毛细管电压为−150 V，获得质谱。采用安捷伦化学站软件进行色谱分析。
放射性分析（液体闪烁计数）。
大鼠样品中的放射性通过使用Wallac 1409自动液体闪烁计数器（Beckman Coulter公司，富勒顿，CA）液体闪烁计数定量。尿和血浆样品直接与优金LSC鸡尾酒（珀金埃尔默生命与分析科学，波士顿，MA）混合。对于增溶组织样品，Goldisol（2毫升）加入到每个小瓶中。然后将小瓶中温育过夜（在约50℃下进行约16小时）。的Ultima金闪烁鸡尾酒（10毫升）和甲醇（1ml）加入到每个小瓶中。粪便的氧燃烧和骨进行使用自动样品氧化剂。燃烧产物在单相小号被吸收的放射性浓度的测量。
氚交换的评价。
的交换（％）的程度3.H-放射性标记与身体水从外推到易失性的放射性的无穷大的曲线（AUC）下的终端速率常数和面积计算（假定为3.H2O）使用表达式：100×（V·k·AUC）/D，其中V是分布容积3.H2O(毫升;可交换身体水分=体重的60%)(里士满等人，1962年）k是终端速率常数3.H2O（小时−1;使用挥发性放射性数据)，AUC是等离子体下的区域3.H2O(挥发性放射性)浓度-时间曲线，表示为毫微克·小时每毫升，和D为给药剂量(微克)。
代谢物谱通过无线电高效液相色谱法和鉴定通过随后的分级和LC-MS / MS分析3.H] -Volanesorsen样品。
所选的血浆、组织和尿液样本提取使用的方法的变化，在以前的报道Turnpenny等人(2011)。通常情况下，样品要么与含50的水混合，要么在水中均质μ摩尔EDTA。（：24：1 25）液 - 液萃取通过首先将氨溶液，接着用苯酚/氯仿/异戊醇进行。将得到的含水提取物中加入二氯甲烷，以水层中，然后将其在离心蒸发器中干燥，并在200重建它进一步纯化μ的50升μ摩尔EDTA：5mM的TBAA用20％乙腈（1：1，V / V）。
重构的样品注射在Agilent 1200系列HPLC系统（Agilent Technologies）中，其中包括一个LabLogicβram(模型3;LabLogic公司，坦帕市，佛罗里达州)与Gilson FC204馏分收集器(Gilson Inc.， Middleton, WI)生成放射色谱图(或放射性剖面)。每隔1分钟收集无线电高效液相色谱的组分，并将其划分为一个区域(在整个运行过程中收集了24个区域)。
使用Waters HPLC的Acquity和Waters Micromass来Q-TOF微型进行了24个区域的随后的代谢物分析身份。样品注射到在XBridge寡核苷酸BEH C18（2.5μm, 50×2.1 mm, 130 A柱;使用Phenomenex security guard C18, 4×3 mm柱(Phenomonex Inc.)，保持60℃，流速0.3 ml/min。用400mm 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇/ 15mm三乙胺和10%甲醇平衡柱。MS条件设置为负电喷雾电离，毛细管电压2.5 kV，氮气溶析气体500 l/h，氮气锥气体50 l/h，溶析温度350℃，扫描范围400-1500 amu，扫描速率1.0秒/扫描。
定量全身放射自显影。
经单次皮下注射[3.H]-volanesorsen (25 mg/kg)给4只雄性和4只雌性大鼠，分别在以下时间点处死1只雄性和1只雌性大鼠:给药后和2、8、48和336小时。每具尸体都被深冻在浴缸里n庚烷/固体有限公司2在约-80℃下之前安装在羧甲基纤维素的块。放射性血液标准在3.35，6.11，51.9，554和4950的浓度μ克当量/克被包括在每个块中，使得它们出现在拍摄每个部分。矢状切面（30μ米厚）的制备和安装到macrotome的阶段中保持在大约-20℃下在低温恒温器。然后将切片暴露于7天荧光成像板（存储在铅衬盒），在这之后将板使用FLA5000 radioluminography系统扫描。使用验证TINA放射性图像数据采集软件生成的图像和量化使用验证Seescan2密度软件。
Volanesorsen和代谢物浓度计算的相对丰度。
用六条校准曲线测定血浆和尿液中沃拉森及其代谢物的浓度，一条为母体沃拉森曲线，五条为代谢物曲线;5个代谢物分别为3’缺失的19-mer (ISIS 489608)、3’缺失和5’缺失的两个10-mers (ISIS 489609和ISIS 489610)、3’缺失和5’缺失的两个5-mer翅膀(ISIS 489611和ISIS 489612)。每种化合物在每个基质中都有一个曲线，用于其各自的定量(表格1)。如果一个代谢物没有一条完全相同的曲线，那么就用最接近的代谢物具有同样最充足的电荷状态的曲线来代替。血浆和尿液样本中总寡核苷酸的浓度被计算为亲本volanesorsen和其定量链缩短寡核苷酸的浓度之和;计算相对丰度(%)为各寡核苷酸浓度除以总寡核苷酸浓度乘以100。
volanesorsen的定量范围和用于血浆和尿液代谢物选择校准曲线（小鼠，猴和人）
下限值定义为定量的下限，上限值定义为定量的上限。黑体字和下划线的核苷酸是2 ' - o -(2-甲氧基)修饰的。所有的胞嘧啶都被5甲基化。
在组织中，亲本ASO及其代谢物的相对丰度是通过将识别为个体的ASO UV峰的面积，通过比较已知的标准，由所有峰的面积相加并乘以每个寡核苷酸的100样品浓度估计低于定量极限在计算相对丰度被列为“0”和为“0”处理。有在任何大量样品中观察到的代谢物的不显而易见的性别差异;因此，在血浆和尿液这些部分的丰度通过用性别组合为小鼠，猴和人的时间点总结。
剂量排泄计算的百分比。
剂量排出母体药物和所有检测ASO相关的物种总和的百分比在小鼠，猴和人尿计算。volanesorsen的摩尔浓度和所有相关的代谢物是基于它们的质量浓度可以通过计算的分子量除以（纳克每毫升）来计算。每个volanesorsen分子产生长度可变的，其volanesorsen当量浓度作为其摩尔浓度由2代谢物分割计算小于或等于四个碱基长太短要检测两个翼部分，用于从所述其它翼代谢物创建异常of those metabolites (i.e., metabolites that were 16–19 bases long), which did not warrant dividing their molar concentration by 2. The amount of volanesorsen and each individual metabolite (micromoles) and volanesorsen-equivalent concentrations of each metabolite (micromole) was calculated using the following equation:
在那里,Aet是量volanesorsen，每种代谢物，或volanesorsen相当于排泄长达24小时的（微摩尔）;C尿是volanesorsen或volanesorsen的个别代谢物的尿浓度（nanomolars）;和V尿是总尿量排泄在24小时收集间隔（毫升）。
在大鼠尿液的24小时收集间隔以下排泄总寡核苷酸的量计算为volanesorsen的量（微摩尔）和每种代谢物的总和。施用剂量的在尿中排泄的百分比然后从下面的表达式计算：
在那里,AeT，如参见。=阂t/2代谢物15个碱基长或短;AeT，如参见。是volanesorsen当量的排泄长达24小时（微摩尔）的量;和给药剂量（微摩尔）由剂量（毫克）计算乘以1000，并通过分子量除以。
结果
血浆蛋白结合
在小鼠、猴子和人类的血浆蛋白上，Volanesorsen同样高度结合。在5℃时，蛋白结合程度大于98%μ克/ ml，在150略低μ克/毫升（仍然大于97％）在所有三个物种（表2)。
等离子体动力学特性在小鼠，大鼠，猴子和人类
所述volanesorsen药代动力学结果在小鼠，大鼠，猴单和多剂量皮下给药，和人类都显示出多相血浆浓度 - 时间曲线，从快速分布相和较慢的表观消除相。选择显示为较低的剂量，临床相关的动物实验药代动力学参数与人类参数一起表3。volanesorsen的血浆浓度一般达到峰值在小鼠中0.5小时后，在大鼠中1个小时，1-4小时在猴子和2-6小时在人类（参考图1)。
选择的药代动力学参数的比较跨越volanesorsen的物种以下皮下注射
血浆药代动力学参数[平均值±s.d;T最大，中值（最小 - 最大）]对于小鼠和大鼠通过使用稀疏取样函数非房室方法计算。鼠（3.1H）-volanesorsen研究浓度表示为每毫升的volanesorsen微克当量。
很少有或者在平均血浆无论是男人还是猴子没有积累C最大或AUC重复给药后，血浆消除半衰期相似[猴子，12.7-36.2天;人类，11.7-31.2天（在所有剂量的测定）]，反射来自组织缓慢代谢和消除。[表观半衰期3.H] -volanesorsen在大鼠血浆和血液分别约为1.26和4.96天，分别，这很可能低估由于几个浓度低于定量在消除相的极限。氚标记放置在volanesorsen（图1）是稳定的;氚交换的程度是剂量仅为1.5％（未显示数据）。当掺入2'-MOE部分修饰的寡核苷酸的间隙，存在与水广泛交换;然而，当结合到翼，用水交换量急剧降低（伊奥尼斯内部数据）。
代谢物鉴定和定量小鼠，猴和人
等离子体。
Volanesorsen是最丰富的寡核苷酸在老鼠和猴子血浆样本,占分布阶段> 96%(1小时postdose)和> 63%的总寡核苷酸postdistribution阶段(7天postdose)鼠标,和占总额> 98%的寡核苷酸分布阶段postdose(2小时)和猴子postdistribution阶段。与小鼠和猴子的血浆相似，人血浆样本中主要成分是volanesorsen，在分布阶段(给药后4小时)和分布后阶段均占总检测寡核苷酸的>的99%。
组织。
在小鼠肝脏和肾脏组织样品13周治疗（93天）后取出48小时后，volanesorsen是最丰富的寡核苷酸和占总寡核苷酸> 70％。代谢物与两个初始核酸外切酶介导的裂解（N-1到N-3的代谢物，17-19个核苷酸的长度）和核酸内切酶介导的裂解是一致的（N-5至N-14，在长度6-15个核苷酸）是明显的在肝脏和肾样品，与所述N-1（或19聚体）作为最丰富的。使用UV色谱初始分析表明，N-15（5聚体）的代谢物不存在于样品中;然而，当样品用更灵敏的方法（通过LC-MS / MS）上运行，既5聚体能够以低丰度被检测到，虽然。从两个外切和内切核酸酶介导的代谢的代谢物从13周（93天）到恢复时间点（第182天）后结束的时间处理增加。13周恢复后volanesorsen的量已经减少到<总寡核苷酸的50％。
13周治疗（93天）后48小时采取的猴肝和肾组织的样品表现出了类似的代谢轮廓小鼠，包括volanesorsen是最丰富的寡核苷酸检测（>总寡核苷酸的82％）。代谢产物外切酶介导的裂解一致都是肝和肾皮质样品以及推定的核酸内切酶代谢产物低水平明显。治疗的最后一天以下13周后volanesorsen的量降低至48％-52总寡核苷酸％。
尿。
小鼠，猴和人类尿液样本都有代谢产物与两个外切和内切核酸酶介导的代谢一致。与完整volanesorsen相比代谢物的程度对于所有尿样大得多，用小鼠的尿在0-24小时的时间点除外。在大多数样品中最丰富的个体的代谢产物是7-聚体（从3'-或5'-缺失或者生成）。人尿中对在小鼠或猴尿液中发现被发现两种代谢物，从5'-缺失和从5'-缺失的16聚体，18聚体;然而，两者都是在非常低的水平（<总寡核苷酸的0.1％以上排泄24小时）。图2比较三种动物的血浆、组织(小鼠和猴子)和尿液中选定的代谢概况。
小鼠、猴子和人血浆中代谢物相对丰度百分比的比较C最大和槽（A）;（B）小鼠和猴肝和肾48小时给药后和最终剂量（B）经过13周;和小鼠，猴，和从0到24小时的单个或多个剂量和小鼠及猴后24-48小时多剂量（C）后的人尿。每个条代表二至六个测量的平均值。误差线是S.E.M.
排泄。
在小鼠中，在0-24小时和24-48小时内，80 mg/kg的完整volanesorsen的平均尿液排泄分别为60.9%和4.7%，而同期母细胞和代谢物的总排泄为74.2%和16.3%。在猴子中，在0-24小时和24-48小时内，20 mg/kg的完整volanesorsen的平均排泄量分别为2.66%和1.46%，而同期总排泄量分别为14%和5.5%。在人体中，在第22天最后一次给药后的头24小时内(接近稳定状态)，完好无缺的伏拉森的尿液排泄量为平均5.7 mg/kg(假设平均体重为70 kg)，非常低，在400 mg剂量时为3.23%。同期总排泄为16.5%。表4比较剂量的跨物种排泄的百分比。
分布，代谢物鉴定，排泄和质量平衡大鼠
等离子体。
来自at的大鼠血浆样本的放射色谱图C最大(2小时后)和24小时后，在5和25 mg/kg剂量水平上，两种剂量水平的质量相似，在2小时后，唯一主要的循环放射性成分为涡拉尼松，占样本放射性的64%-71%。在剂量后24小时，完整的volanesorsen或其代谢物都不能在血浆样本中被确定。
组织。
在给药24小时后，以5和25mg / kg的两种剂量水平获得从肝，肾样品的放射性分布。从肝脏样品在两种剂量水平的放射性曲线是相似的，与volanesorsen是唯一的肯定地识别ASO，分别占56％和68％-79从低和高剂量组的样品的放射性％。样品radiochromatograms含有至多其中放射性水平以上定量限14成的区域（24个总区域的）;但是，没有代谢物能够在随后的LC-MS / MS分析来肯定地识别。
肾脏样本的放射性剖面在两个剂量水平之间也相似。样品放射色谱图显示，有多达九个地区的放射性高于定量限制。在低剂量组和高剂量组的样品放射性中，沃拉内森仍然是主要成分，分别占63%和59%-62%。三种代谢物经质谱确证在肾脏样本中，但其中只有两种附着了放射性标签;因此，在随后的计算中只使用这两个。还附着着radiolabel的两个是3 '缺失的7-mer和3 '缺失的8-mer。未检测到radiolabel的代谢物是5 '缺失的6-mer。虽然在肾脏中残留的代谢物也被质谱鉴定，但代谢物在两个剂量水平的总ASO中确实占了较大的百分比。
尿。
5 mg/kg(混合)和25 mg/kg动物在给药后0 - 6小时和6 - 24小时的大鼠尿液样本的特征显示了定性相似的放射性剖面(时间间隔和剂量水平)。主要的尿代谢物(>10%的提取物放射性)是6-聚体(来自3 ' -缺失;和7-mer(来自3 '缺失;16%-29%)。在5 mg/kg和25 mg/kg的剂量下，0 - 24小时内，完整的volanesorsen也存在，分别占2.5%和10.7%。放射色谱图显示，其他几个区域的放射性分解很差，这些区域有广阔的放射性区域，而不是明显的峰值，通常每个区域的放射性含量都低于样品的5% (参考图2)。
排泄。
在动物中施用的5mg / kg的剂量的平均总剂量的58％被回收在排泄物在1344小时给药后，其中最大的比例（平均值的48％）在尿中回收，用8％回收在粪便和剂量的另外的2％回收笼子洗涤。放射性排泄通过1344小时接近完成，因为只有平均0.13％的剂量在这个时候留在胃肠道中的内容。尿排泄时，回收给药量的9％时0-6小时是最快速。剂量的进一步的4％时6-24小时给药后回收。此后，给药剂量的1％在尿中的每一天中回收直到每日集合，不再在168小时。从168至1344小时每周24小时收集物外推使得剂量的估计4％至5％的经尿每个周排出，长达6周。通过尿液排泄每周下降到7周的剂量的3％，并且在8周剂量的2％。完好volanesorsen出席了尿处于低电平，占从0到24小时剂量的0.33％。
放射性的从在0-24小时收集期间排泄物从动物施用的更高（25毫克/千克）的剂量的回收率为20.04％-23.82剂量，其中几乎所有的是在尿（仅0.48％的％-0.97剂量的％是在粪便中）。完好volanesorsen也存在尿中和为1.34％剂量的-2.09％（表4)。
定量全身放射自显影。
在2,8，48，和336小时放射性的组织浓度从测定通过定量全身放射自显影得到的雄性和雌性大鼠给药后，并且被呈现图3。血浆浓度比相应的血液值低于2小时和8小时给药后但在48和336小时保持可测量的。随给药皮下途径相一致，在所述剂量注射部位观察到高水平的放射性。随着剂量的网站外，肾脏含有放射性浓度最高，其次是肝脏，其在48小时给药后达到最大浓度。正如预期的那样，大脑和脊髓有小到无放射性的所有时间点，由于ASO的不能穿过血脑屏障。
以下的单次皮下施用在通过定量全身放射自显影组织中的放射性浓度[3.H] -volanesorsen以25mg / kg至雄性大鼠（每个时间点一个动物）。
讨论
药代动力学和volanesorsen的新陈代谢都跨物种已彻底调查。在所有物种中，volanesorsen表明剂量依赖性和多相血浆浓度 - 时间曲线，从快速分布相和较慢的消除相。有很少或没有血浆积累C最大或AUC，血浆消除半衰期相似(猴子和人类均为2-4周)，反映了组织中代谢和消除的缓慢。在大鼠中较短的半衰期(1-5天)被低估了，因为在单剂量给药后的消除阶段，有几个浓度低于定量限制。
与其他2 ' -MOE部分修饰的ASOs一样，Volanesorsen在小鼠、大鼠和猴子之间具有类似的组织分布特征，其在肝脏和肾脏的浓度最高((Geary等人，2003年;Levin等人，2007年;Yu等人，2015年））。人们普遍认为，艾滋病服务分配到通过受体介导的内吞作用的组织（克鲁克等人，2017年），而不是被动扩散。内吞细胞摄取可被认为是主要单向的，而事实上在ASO浓度非常大的组织 - 血浆浓度梯度（~5000：1）在临床前物种和人（通常观察基尔，2009年;Geary等人，2015年;Wang等，2018)。ASO回到血浆的缓慢分布可能与细胞周转率(细胞死亡)或非常缓慢的可逆分布从组织回到血浆有关。进一步的研究将有助于更好地了解ASO化学、细胞类型和周转、血浆和组织蛋白结合对组织摄取ASOs的影响。
2'-MOE部分改性的ASO缓慢地通过组织中的核酸酶在deoxyphosphorothioate间隙内的不同位置代谢，主要是通过内切核酸酶水解，接着通过随后的3'和5'外切核酸酶的形成的代谢产物的暴露末端脱氧核苷酸的水解（图4)。在等离子体中,释放和弱耦合chain-shortened寡核苷酸代谢产物和其他剩余的(high-binding)父药物是通过肾脏肾小球滤过,父母的麻生太郎基本上由肾脏近端小管reuptaken低剂量时(吸收是在线性范围内),作为一个网站肾脏的新陈代谢(吉尔里等。，2003;宇等。，2007年）。
Volanesorsen广泛分布在肝脏和肾脏组织。在猴子的剂量为4 mg/kg时(类似于300 mg临床剂量)，肾皮质的volanesorsen暴露量比肝脏高出约50%。尽管如此，在最后剂量的沃拉内森后，肾脏、皮质和肝脏之间观察到一个平行的消除阶段。在两个组织中观察到相似的相对比例的ASO代谢物，表明肝脏和肾脏在ASO代谢中的作用相同。
第二代ASOs的代谢生物转化和排泄途径。
研究了在a和b两种动物体内的volanesorsen代谢3.H-放射性标记的鼠ADME研究，并在小鼠和猴子的非标记的研究。缺乏从大鼠ADME研究中获得的结构信息可能是由于仅具有volanesorsen的单次施用（而不是多次施用）和样品净化不充分。在这项研究最初的提取方法有最小的处理以增加代谢物的绝对复苏。在基质的增加，预期和计划是在线清洁，即，经由该无线电高效液相色谱法的分级分离。然而，许多基质与许多代谢物（特别是短的）的共洗脱和无法被进一步处理，从而导致信号抑制由于基体效应。因此，即使利用放射性标记的ASO的ADME研究有许多好处显而易见的是，使用单剂量的研究，探讨代谢对于被广泛分布到组织中的化合物，其中所述代谢发生可能不理想。该研究设计应该更加反射性的，其中所述药物将在诊所进行给药的方式。然而，整体组织分析评估论证的三个品种之间的相似性，以及类似的意见将在人体组织中的提取物可以预期的。
在整个评价物种尿母体药物的相对丰度似乎与给药，80毫克/千克小鼠，20mg / kg的在猴中的剂量，和400毫克（5.7毫克/千克）在人，与更高毫克/公斤的剂量，导致可能归因于血浆或volanesorsen少分数较高的游离分数在较高的剂量水平在近端小管再吸收尿中的母体药物的更大的相对丰度。尿过的小鼠24小时给药后段消除毒品有关的部分的总比例，猴子和人类在稳定状态一般出现尿消除是用于部分2'-MOE修饰的艾滋病服务组织和主要排泄途径是一致的相关的代谢产物。
值得注意的是，在不同尿的volanesorsen从有些什么已经报道了其他部分2'-MOE修饰的ASO已经代谢图谱。在以前的nonradiolabeled尿液代谢研究，艾滋病服务六大基地长或更少未检出，以及艾滋病服务从15到19个碱基，而所有这些代谢产物在这项研究中被发现。而较长的ASO代谢物的丰度是非常低的，在5位和6聚体的浓度是相当高的。这种差异很可能不是由于代谢先前的ASO和volanesorsen之间，而是由于改善的提取方法的差（伊奥尼斯内部数据）。以前的报告中使用了两步骤中，固相萃取（强阴离子交换接着是C18），其结果在短代谢物的非常低的，绝对回收率（五到七个碱基长）。本报告中采用的方法有艾滋病服务较高的绝对回收率从长度是5到20个碱基，并能够捕获整个代谢轮廓比以前好多了(吉尔里等。，2003;宇等。，2007年）。先前报道的使用这些旧的提取方法治疗ASOs的尿液中ASO总恢复率可能低估了实际价值。这些改进的方法我们能够生成质量平衡数据显示大约16.5%的复苏剂量的24小时postdose区间,这将导致完全恢复服用剂量的假设相同的排泄的每个其他每周6天剂量间隔(一个合理的假设考虑长半衰期麻生太郎的组织)。
尽管改进了提取方法，但LC-MS/MS在检测和定量治疗相关剂量的亲本ASOs和代谢物方面仍存在局限性。最近对ASOs及其代谢物的定量测定进行了综述(Kaczmarkiewicz等人，2019），以及虽然已经在本申请中的许多进步，但它仍然是一个复杂的多变量的问题，可以使实现定量困难（尤其是对于低谷血浆浓度，这往往是所希望的下限<1ng / ml的代谢物）。有趣的是，大多数已公开的方法采用使用多重反应监测他们的MS检测和离子对即产率大的电荷状态分布。这里所用的策略是使用离子对TBAA创建窄电荷状态分布和在扫描模式下操作的MS，导致在全长一个为代价增加了代谢物的信号。这一妥协使得我们每一个代谢5至19个碱基的单次运行特征。
总之，volanesorsen的ADME特性是整个调查物种相似，都具有相同化学类的其他艾滋病服务的以前的报告一致（基尔等。，2003,2015年,宇等。，2007年,2013)。最终，这些发现与在母体化合物的中心间隙内的不同位置volanesorsen代谢为初始核酸内切酶介导的水解的主要模式一致，然后通过随后的外切核酸酶（3'和5'） - 介导的脱氧末端的水解形成的代谢产物。此外，这项研究还提供结果和消除一切volanesorsen相关的部分是尿排泄的主要途径是一致的。
致谢
作者感谢Shannon Hall和Christine Hoffmaster帮助找到完成手稿所需的基本信息，Scott Henry的支持和评论，以及Wanda Sullivan的行政协助。
原创贡献
参与研究设计:邮政，宇王。
进行实验：职位。
进行数据分析：邮政，羽。
撰写或参与撰写手稿的:后，余秋雨，格林利，GAUS，Hurh，美森，王。
脚注
- 收到2019年4月2日。
- 接受2019年7月24日。
N.P.，R.Y.，S.G.，H.G.，J.M.，和Y.W.是伊奥尼斯制药公司E.H.的员工和股票持有者是Akcea治疗的雇员和股票持有者。
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这篇文章有补充材料可在www.3tejia.com。
缩略语
- ADME
- 吸收、分布、代谢和排泄
- APOC3
- 载脂蛋白C-III
- ASO
- 反义寡核苷酸
- AUC
- 曲线下面积
- LC-MS / MS
- 液相色谱-串联质谱
- 2'-MOE
- 2′-O- （2-甲氧基乙基）
- 多发性硬化症
- 质谱
- TBAA
- tributylammonium醋酸
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![Concentrations of radioactivity in tissues by quantitative whole-body autoradiography following a single subcutaneous administration of [3H]-volanesorsen at 25 mg/kg to male rats (one animal per time point).](http://www.3tejia.com/content/dmd/47/10/1164/F3.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
