摘要

在过去的50多年里，关于细胞色素的刺激作用有许多研究报道b₅（b₅在一些，但不是全部，微粒体细胞色素P450 (P450)反应与药物和类固醇。在大多数这些研究中缺少的一个元素是敏感和准确的结合亲和力的测量b₅p450酶类。在使用P450 17A1的过程中，我们开发了一种人的荧光衍生物b₅位点定向突变体，Alexa 488-T70C-b₅，可用于亚微米浓度的结合分析。Alexa 488 - t70cb₅与人类p4500s 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2E1, 2S1, 4A11, 3A4, 17A1结合，估计K_d值范围为2.5 ~ 61 nM。P450 2D6仅检测到弱结合，P450 2A6未观察到荧光衰减。所有的p450b₅除P450 2S1外，有一些报道的活性刺激。P450 3A4的亲和力为b₅由于底物或抑制剂的存在而有所减少。荧光的P450 3A4•Alexa 488-T70C-b₅用NADPH-P450还原酶(POR)滴定部分恢复复合物(K_d,明显89 nM)，表明存在三元P450 3A4-b₅-POR复合物，如之前观察到的P450 17A1。该三元配合物与P450 3A4也获得了凝胶过滤证据。总的来说，结果表明，亲合力b₅对于许多P450是非常高的，而且三元P450-b₅-POR配合物与P450 3A4反应有关，而不是穿梭机制。