摘要gydF4y2Ba
描述候选药物的药代动力学特性是药物开发过程中的一项重要任务。过去，肝微粒体和原代悬浮肝细胞已被广泛用于这一目的，但它们相对较短的稳定性限制了此类体外系统对代谢转化率低的药物化合物的适用性。在目前的研究中，我们使用三维原代人肝细胞球状体来预测7种低到中度清除的药物在人体内的肝脏清除情况。我们的研究结果表明，肝细胞球形细胞在长时间的孵育过程中维持其在体内的表型，可监测母体药物耗尽7天。相反，通过聚集肝细胞球形细胞来增加相对代谢能力的尝试会导致球形细胞立即融合，随后肝细胞去分化过程，这表明聚集方法在定量药代动力学研究中的适用性有限。用单个球体孵育得到的肝脏清除率值与临床参考数据密切相关，7种药物中有6种预测误差在3倍以内，平均和绝对平均误差分别为0.57和1.74。总之，肝细胞球形模型能够准确预测缓慢代谢的药物化合物的肝脏清除率，并为确定新药候选药物的药代动力学特性以及药代动力学机制研究提供了有价值的工具。gydF4y2Ba
重要性声明gydF4y2Ba传统的体外系统往往不能预测肝脏对缓慢代谢的药物化合物的清除。目前的研究表明，初级人肝细胞球形细胞能够提供准确的肝清除率预测药物化合物的低清除率和中清除率。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
适当的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特性对于选择候选药物和避免药物开发项目的后期失败至关重要。因此，在药物发现的早期阶段，新的化学实体通常要进行体外高通量ADME筛选，以识别和消除具有不良药代动力学特性(如半衰期短和生物利用度差)的化合物。在先导物优化过程中，药物化学家进一步提高了先导物的代谢稳定性和其他药动学性质(gydF4y2BaObach等人，1997年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKratochwil等人，2017年gydF4y2Ba）.因此，大量进入临床前开发的化合物在代谢稳定性分析中表现出低或无周转，通常在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在的情况下使用肝微粒体进行代谢稳定性分析(gydF4y2BaDi和Obach, 2015gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
尽管延长代谢稳定性是一种非常理想的药代动力学属性，允许每日一次给药方案，但在后期的临床前开发中，这种低清除化合物的特性对ADME科学家来说是极具挑战性的。因为用于筛选试验的普通体外系统不再适用。临床前测试进一步受到以下事实的挑战:不仅代谢缓慢的化合物，而且非氧化代谢(例如，尿苷5 ' -二磷酸葡萄糖醛酸转移酶的II期结合反应)和肝脏代谢以外的途径(例如，通过微粒体筛选方法优选转运体介导的通透性或肝外代谢(gydF4y2BaArgikar等人，2016年gydF4y2Ba）.例如，通过添加相应的辅助因子，可以在微粒体孵育中覆盖尿苷5 ' -二磷-葡萄糖醛酸转移酶介导的代谢，而微粒体组分缺乏胞质酶，同样不适用于具有低(限速)主动和/或被动渗透性的化合物(gydF4y2BaKusuhara和Sugiyama, 2009年gydF4y2Ba；gydF4y2BaCamenisch 2016gydF4y2Ba）.原发性肝细胞的使用可以在一定程度上满足这些挑战,因为他们表达整个肝摘要酶和转运蛋白,然而主要的肝细胞迅速de-differentiate悬挂或二维单层培养和酶和转运蛋白的活性开始减少几小时(gydF4y2BaDi和Obach, 2015gydF4y2Ba）.对于体外代谢清除率低的药物化合物，这个时间太短，无法充分消耗母体药物化合物，从而实现可靠的内在清除率(CL)gydF4y2BaintgydF4y2Ba)估计(gydF4y2Ba陈等人，2013年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKratochwil等人，2017年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
最近，三维球形培养的原代人肝细胞已经建立，允许培养表型稳定的肝细胞数周(gydF4y2BaLin and Chang, 2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaMessner et al.， 2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba）.本实验室广泛的特性研究表明，原发性人肝细胞球形细胞随时间的推移保持其形态、活力、肝细胞功能和药物代谢酶活性，与体内肝细胞非常相似(gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaVorrink等人，2017年gydF4y2Ba）.此外，我们已经成功地将肝细胞球体应用于肝毒性筛选和机制研究以及肝脏疾病的建模(gydF4y2Ba亨德里克斯等人，2016年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKozyra等人，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2BaVorrink等人，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba亨德里克斯等人，2019年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHurrell等人，2020年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
在本研究中，我们建立了初级人肝细胞球形细胞作为一种新的体内外推(IVIVE)工具，用于预测低和中循环药物的肝脏清除。肝细胞球形细胞功能验证后，CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba测定了不同细胞色素P450 (P450)酶代谢的7种中、低清除率药物中的7种，并与临床参考数据进行了比较。此外，从细胞形态、肝细胞功能、肝药物代谢酶和转运蛋白的表达等方面研究了汇集单个球体增强代谢能力的作用。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
细胞培养gydF4y2Ba
低温保存的原代人肝细胞取自美国的BioreclamationIVT或法国的KalyCell。肝细胞的供体信息综述于gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba．肝细胞按照制造商的说明解冻，肝细胞球体如前所述生成(gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba）.简单地说，来自个体供体的肝细胞被接种在含有2 mM的培养基中[Williams' E培养基(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)]gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺，100单位/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，100 nM地塞米松，5.5 μg/mL转铁蛋白，6.7 ng/mL亚硒酸钠，10%胎牛血清]，96孔超低附着板(美国康宁)，每孔1500活细胞密度。第5天细胞聚集后，用无血清培养基替代培养基，第7天开始接触药物。gydF4y2Ba
Media-Loss化验gydF4y2Ba
体外CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba7种药物的低清除率[阿哌沙班(CYP3A4)、卡马西平(CYP3A4)、氯氮平(CYP1A2)、奥氮平(CYP1A2)]和中清除率[去甲替林(CYP2D6)、利培酮(CYP2D6)、文拉法辛(CYP2D6/CYP2C19)]持续7天。肝细胞球形细胞置于含有1 μM阿哌沙班、1 μM卡马西平、1 μM氯氮平、0.1 μM去甲替林、1 μM奥氮平、0.01 μM利培酮或1 μM文拉法辛的无血清培养基中，37℃，5% COgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在潮湿的培养箱中。名义药物浓度至少比报道的Michaelis-Menten常数(Km)低10倍(gydF4y2Ba环等，1996gydF4y2Ba；gydF4y2BaLinnet和Olesen, 1997年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba福格曼等人，1999年gydF4y2Ba；gydF4y2BaVenkatakrishnan等人，1999年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYasui-Furukori等，2001年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba卡扎利等人，2003年gydF4y2Ba；gydF4y2BaWang et al.， 2010gydF4y2Ba)，以避免药物代谢酶饱和(gydF4y2BaObach 2001gydF4y2Ba）.所有孵育过程中DMSO浓度均调整为0.2%。去甲替林、利培酮和文拉法辛只在供体C进行研究，该供体C被鉴定为CYP2D6广泛代谢物(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba）.在指定的时间点(10分钟、4小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和168小时)，从3口井中提取40 μL培养基，用240 μL含内标物(0.5 μM apixaban-d)的乙腈进行池化和淬灭gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(加拿大多伦多化学研究公司)，0.5 μM卡马西平dgydF4y2Ba8gydF4y2Ba(加拿大多伦多化学研究公司)，0.5 μM [gydF4y2Ba13gydF4y2BaC,gydF4y2Ba2gydF4y2BaHgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba-氯氮平(Alsachim，法国)，0.05 μMgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba盐酸(多伦多研究化学品，加拿大)，0.5 μM奥氮平dgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba(CDN同位素，加拿大)，0.005 μM利培酮dgydF4y2Ba4gydF4y2Ba，或0.5 μM D, l -文拉法辛- DgydF4y2Ba6gydF4y2Ba(加拿大多伦多化学研究公司))。经过一个冻融循环后，样品以14000 ×的速度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定上清液中药物浓度。gydF4y2Ba
UPLC-MS / MS分析gydF4y2Ba
使用样品制备程序和经验证的用于治疗药物监测的UPLC-MS/MS仪器对试验药物进行分析。样品与等量含内标液的冷乙腈/甲醇(90:10)混合5秒，−20℃冷冻10分钟，3100 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在2°C下保存10分钟。样品注入BEH Shield RP18色谱柱(1.7µm, 1.0 × 100 mm;以乙腈-乙酸铵缓冲液(10 mM, pH 4.8)为流动相梯度，在Acquity UPLC系统(Waters)上以0.2 mL/min的流速洗脱。分析物浓度的测定使用Quattro Premier质谱仪(Waters)，该质谱仪在正电喷雾电离多反应监测模式下操作，使用每种化合物的选定过渡。从含有各自化合物的工作溶液中制备校准标准品和质量控制样品，并根据试验药物调整UPLC梯度。分析分析的性能符合美国食品和药物管理局规定的一般要求，所有分析物的日内和日间误差和不精密度均小于15%。gydF4y2Ba
体外清除数据的处理gydF4y2Ba
体外CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba(μL / min / 10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba从母细胞药物耗尽的线性阶段根据gydF4y2Ba情商。gydF4y2Ba（gydF4y2BaObach等人，1997年gydF4y2Ba)：gydF4y2Ba
kgydF4y2BaegydF4y2Ba(h)为消去率常数，表示剩余母药ln转化百分数随孵育时间线性回归的斜率。肝细胞和肝脏重量的缩放因子取自gydF4y2Ba史密斯等人(2008gydF4y2Ba),gydF4y2Ba戴维斯和莫里斯(1993)gydF4y2Ba),分别。通过确定培养基中初始时间点(即应用给药溶液后10分钟)中代表无血清培养基中未结合初始药物浓度的母体药物浓度，考虑了孵育结合。gydF4y2Ba
肝器官间隙(CLgydF4y2BahgydF4y2Ba)，用搅拌均匀的肝脏模型进行了预测gydF4y2Ba情商。gydF4y2Ba（gydF4y2Ba庞和罗兰，1977年gydF4y2Ba)：gydF4y2Ba
问在哪里gydF4y2BahgydF4y2Ba肝血流(20.7 mL/min/kg)与fu是否一致gydF4y2BabgydF4y2Ba是血液中未结合的部分(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba）.临床药动学参数用于推导临床参考CLgydF4y2BahgydF4y2Ba中提供了数据及相应的文献参考gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba临床化学gydF4y2BahgydF4y2Ba这些值是根据总口服血浆清除率得出的，考虑到口服生物利用度和肾脏药物清除率的部分贡献，假设只有肝脏和肾脏药物清除率，并且如补充材料中所述，人体体重为70公斤。根据相应的肝提取比(EgydF4y2BahgydF4y2Ba) (EgydF4y2BahgydF4y2Ba= CLgydF4y2BahgydF4y2Ba/ QgydF4y2BahgydF4y2Ba)在人类中，低（CLgydF4y2BahgydF4y2Ba< 6.2 mL/min/kg)和中等肝清除率(6.2 < CL .gydF4y2BahgydF4y2Ba< 14.5 mL/min/kg)指EgydF4y2BahgydF4y2Ba< 0.3和0.3 < EgydF4y2BahgydF4y2Ba< 0.7，分别(gydF4y2BaBenet和Zia-Amirhosseini, 1995年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
使用f检验(GraphPad Prism 9.0.1, Suite, US)确定母体药物消耗随时间的统计学意义。浓度-时间曲线的斜率被认为显著非零，如果agydF4y2BaPgydF4y2Ba值<0.05。CL的准确性gydF4y2BahgydF4y2Ba通过计算平均折叠误差(AFE)和绝对平均折叠误差(AAFE)来评价预测结果gydF4y2Ba情商。gydF4y2Ba和gydF4y2Baeq。4gydF4y2Ba分别为:gydF4y2Ba
其中pred和obs是预测和观察的CLgydF4y2BahgydF4y2Ba值，N为数据点个数。gydF4y2Ba
细胞活力gydF4y2Ba
根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)，通过测定细胞ATP含量来评估肝细胞球形细胞的活力。用MicroBeta LumiJET 2460微平板计数器(Perkin Elmer)测量每个球体的发光。gydF4y2Ba
白蛋白分泌gydF4y2Ba
根据说明书使用人白蛋白ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories)定量测定细胞培养基中白蛋白的浓度，以测定肝细胞球形细胞分泌白蛋白的情况。gydF4y2Ba
基因表达分析gydF4y2Ba
用Qiazol Lysis Reagent (Qiagen)分离总RNA。使用SuperScript III逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，并使用TaqMan Universal mix和TaqMan探针进行反转录聚合酶链反应(gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba)。数据分析使用2gydF4y2Ba——ΔΔCtgydF4y2Ba方法和塔塔结合蛋白作为管家基因。gydF4y2Ba
CYP3A4蛋白表达gydF4y2Ba
用RIPA Lysis and Extraction buffer (Thermo Fisher Scientific)添加cOmplete蛋白酶抑制剂(Roche, Switzerland)从肝细胞球形细胞中提取总蛋白。采用Bradford法测定蛋白含量，用10% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶(Bio-Rad Laboratories)分离25µg蛋白，并转移到amershamextran膜(GE Healthcare Life Sciences, UK)上。用抗cyp3a4 (1:1000, Cypex, UK)和抗vinculin (1:10 000, Abcam, UK)孵育膜，然后用山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(1:10 000,DAKO，丹麦)孵育膜，并使用Super Signal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, USA)进行观察。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
肝细胞球形细胞的活力和功能gydF4y2Ba
肝细胞球形细胞的表型和药物代谢酶活性在数周内保持不变(gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba)，使慢性药物暴露可用于肝毒性筛查和机制研究(gydF4y2BaVorrink等人，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba亨德里克斯等人，2019年gydF4y2Ba）.在代谢活性体外系统中进行慢性肝毒性试验，需要定期提供新的母体药物化合物以替代代谢药物的损失(即每2-3天接触一次药物)。然而，清除实验不允许定期改变培养基来定量监测母体药物的损失或代谢物的形成。特别是，对低清除率药物的调查需要在培养液改变之间的一般时间间隔之外延长培养数天。为了验证在缺乏定期营养供应的情况下持续的细胞活力和功能，我们对肝细胞球形的形态以及作为肝细胞功能标志的白蛋白的分泌进行了超过7天的监测。肝细胞球形的亮视野图像显示，在研究期间，细胞形态和球形大小没有变化(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba）.此外，培养基中的白蛋白浓度随着时间的推移而稳定增加，表明所有供体的白蛋白产生和肝细胞功能均稳定(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba）.供体A、B和C的平均白蛋白分泌率分别为19.9±3.4、23.3±7.5和12.0±5.0 pg/肝细胞/天，其中在体内的白蛋白分泌率为17.8 pg/肝细胞/天(gydF4y2Ba张等人，2015gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
肝细胞球形细胞在长时间的孵育过程中保持存活和功能。(A)供体A肝细胞球形7天的亮视野图像。(B) 7天内肝细胞球形分泌白蛋白的培养基浓度。虚线表示体内白蛋白分泌率[17.8 pg/hepatocyte/day (gydF4y2Ba张等人，2015gydF4y2Ba)]。Δ,捐赠;Ο,捐赠者B;⋄,捐赠者C。gydF4y2Ba
合并肝细胞球形中肝细胞表型的丧失gydF4y2Ba
为了增强肝细胞球形细胞的代谢能力以缩短试验时间，我们假设球形细胞的池化应增加母药的消耗以及代谢物的形成。虽然酶的数量在传统的体外系统如肝微粒体或肝细胞(gydF4y2BaObach 2001gydF4y2Ba；gydF4y2BaNordell等人，2013gydF4y2Ba)，所提出的球形系统仅使用每个球形的1500-2000个肝细胞，以防止球形内缺氧的风险，这在较大的球形中是预期的(gydF4y2BaLin and Chang, 2008gydF4y2Ba）.因此,我们试图增加细胞数量每孵化池10倍的肝细胞球状体(5球状体/ 50μL媒体而不是1球体/ 100μL媒体)在7天完成后球体形成postseeding和调查潜在的形态学变化和肝细胞功能随时间(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
合并肝细胞球形中肝细胞表型丢失。(A)来自供体B的浓缩肝细胞球形7天的亮场图像。(B)合并肝细胞球形7天内白蛋白分泌。虚线表示体内白蛋白分泌率[17.8 pg/hepatocyte/day (gydF4y2Ba张等人，2015gydF4y2Ba)]。(C)合并肝细胞球形7天内的细胞活力(细胞总ATP)。数据点代表四重体±S.D. Δ的平均值，供体A;Ο,捐赠者B;⋄，供体C. (D) 7天期间，合并肝细胞球形中主要肝P450酶和摄取转运蛋白mRNA表达(相对于第0天)的变化幅度。数据点代表供体A、B、C和D肝细胞球形细胞中mRNA表达量变化倍数的平均值。(E) 7天内供体D肝细胞球形细胞中CYP3A4和vinculin的Western blot(负荷对照)。gydF4y2Ba
从亮场图像可以看出，肝细胞球形在聚集后24小时内形成松散的聚集物。48小时后，球体完全熔化，形成固体和紧密的聚集体(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba）.与球体形态的变化相一致，与单个球体相比，聚集的球体中每个细胞的白蛋白分泌减少了约2倍(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)，从供体A、B和C汇集的球形细胞中估计的平均白蛋白分泌率分别为12.1±0.6、11.7±2.2和7.3±1.6 pg/肝细胞/天。相比之下，来自供体A和B的球形细胞在7天内细胞活力稳定，而来自供体C的球形细胞的ATP含量在7天内下降约40% (gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba）.此外，在汇集7d后，分析肝脏主要P450酶和摄取转运蛋白的mRNA表达(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)，表明CYP3A4、CYP2C8、CYP2C9、CYP1A2 mRNA表达迅速下降。而CYP2C19、CYP2D6和有机阳离子转运体1 mRNA表达量下降不到2倍，而有机阴离子转运多肽1B1 mRNA表达量在7 d内未见变化。同样，CYP3A4作为P450的代表性酶，其蛋白表达在汇集球体后立即降低，Western blot几乎检测不到任何CYP3A4蛋白(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba）.相比之下，来自同一供体的CYP3A4蛋白表达在单个孔培养的球体中没有减少。gydF4y2Ba
体外CLgydF4y2BaintgydF4y2BaCL的培养和预测gydF4y2BahgydF4y2Ba
检验技术转移的可行性gydF4y2BahgydF4y2Ba预测:7种据报道肝清除率低至中等的试验药物与单个肝细胞球状体孵育，随时间推移监测母药的消失(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba）.低清除率药物阿哌沙班、卡马西平、氯氮平和奥氮平(报道CLgydF4y2BahgydF4y2Ba在人体内的浓度为0.110 - 3.55 mL/min/kg，gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)与来自供体A、B和C的球状体孵育7天，不改变培养基，以便从孵育中充分去除母体药物。在所有三名供体的肝细胞球形中，四分之三的低清除率药物显著耗竭，浓度-时间分布如图gydF4y2Ba图3,模拟gydF4y2Ba．例外的是卡马西平，在所有供体的肝细胞球形中未检测到明显的母药耗损。虽然不显著，但在与来自供体a和C的肝细胞球形细胞孵育时，检测到母细胞药物浓度随时间的小幅度下降，获得的体外数据显示在gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba，但卡马西平被排除在随后的临床参考数据比较和进一步的统计检验之外。相比之下，在供体B中未观察到卡马西平耗尽(数据未显示)，其浓度-时间曲线未被考虑为预测的CLgydF4y2BahgydF4y2Ba值了gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
肝细胞球形中底物消耗时间分布。(A- d)从供体A、B和C的单个肝细胞球形细胞中消耗低肝清除率化合物(E-G)从供体C的单个肝细胞球形细胞中消耗中度肝清除率化合物(数据来源于两次独立实验)。在细胞培养基中定量测定亲本药物浓度和CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba根据材料与方法中描述的母体药物耗竭的线性阶段估计。数据点为重复样本±S.D. Δ，供体A;O,捐赠者B;⋄和□，供体C。gydF4y2Ba
预测CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba和CLgydF4y2BahgydF4y2Ba数值和临床参考数据gydF4y2Ba
体外半衰期(tgydF4y2Ba1/２gydF4y2Ba)用[h]表示。清除率以[mL/min/kg]表示，参照血液消除。数据代表了在两个独立实验(去甲替林、利培酮、文拉法辛)中，使用来自供体A、B和C的肝细胞球形细胞(阿哌沙班、卡马西平、氯氮平、奥氮平)获得的平均值±S.D.或使用来自供体C的肝细胞球形细胞(去甲替林、利培酮、文拉法辛)获得的平均值±S.D.。临床CL文献参考gydF4y2BahgydF4y2Ba值提供于gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
此外，中间清除药物去甲替林、利培酮和文拉法辛(报道CLgydF4y2BahgydF4y2Ba在人体内的浓度为6.68 - 8.79 mL/min/kg，gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)在供体c肝细胞球形细胞中进行了研究。所有三种药物化合物都被高度多态性的CYP2D6酶(gydF4y2Ba福格曼等人，1999年gydF4y2Ba；gydF4y2BaVenkatakrishnan等人，1999年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYasui-Furukori等，2001年gydF4y2Ba）.便于与临床CL进行比较gydF4y2BahgydF4y2Ba参考数据，仅在供体C孵育，鉴定其具有CYP2D6广泛代谢物(野生型)基因型(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba）.与以前的孵育相似，随着时间的推移，所有三种测试化合物都观察到母药耗尽(gydF4y2Ba图3,eggydF4y2Ba)，但其体外半衰期普遍明显低于所研究的低清除率药物(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba）.因此，使用中间清除药物的孵育可以在3-4天后终止。gydF4y2Ba
接下来，我们执行CLgydF4y2BahgydF4y2Ba基于体外CL的预测gydF4y2BaintgydF4y2Ba，并将所得值与临床参考数据进行比较(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba）.预测的CLgydF4y2BahgydF4y2Ba低清除率和中等清除率的值分别为0.434 ~ 1.64 mL/min/kg和3.00 ~ 5.59 mL/min/kg。与临床参考数据的直接比较表明，预测值与观测值之间存在密切的相关性，AFE为0.57,AAFE为1.74，排除卡马西平(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
预测与观察的CL比较gydF4y2BahgydF4y2Ba数据。数据点代表平均CLgydF4y2BahgydF4y2Ba值±s.d，使用来自供体A、B和C(阿哌沙班、氯氮平、奥氮平)的肝细胞球形获得，或平均CLgydF4y2BahgydF4y2Ba在两次独立实验(去甲替林、利培酮、文拉法辛)中，使用供体C肝细胞球形细胞获得的重复±S.D.值。实线代表统一线，虚线代表三倍偏差。api, apixaban;克罗,氯氮平;也不是,去甲替林;ola,奥氮平;ris,利培酮;ven,文拉法辛。gydF4y2Ba
为了研究肝细胞球体合并后代谢活性的潜在变化，我们监测了供体A、B和C合并球体中低清除率药物阿哌沙班、卡马西平、氯氮平和奥氮平在7天内的消耗情况。与单个球体孵育相比，在所有混合球体孵育中，药物化合物从培养基中清除的程度更高（底物消耗时间曲线如所示）gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba）.然而，在考虑到肝细胞数量后，CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba来自汇集球体的数据较低，明显低估了大多数研究化合物的肝脏清除率。预测与观测的CL之间的褶皱偏差gydF4y2BahgydF4y2Ba数据范围为0.1 - 0.6，四种试验药物的AAFE增加到4.95 (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
预期缓慢代谢药物的清除是特别具有挑战性的，因为一般的体外系统具有短期稳定性，不允许可靠地确定这些化合物的清除(gydF4y2BaDi和Obach, 2015gydF4y2Ba）.在这里，我们建立了初级人肝细胞球形细胞作为一种新的IVIVE工具，用于预测具有低和中度代谢周转的化合物的肝脏清除。肝细胞球形细胞在7天内表现出表型稳定性，允许延长培养时间以量化培养基中母药的消失。使用这个实验装置，我们能够确定体外CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba并成功预测了这些化合物的肝脏清除率，与临床参考数据的偏差为3倍(AAFE为1.74)。gydF4y2Ba
对体外ADME测试系统的需求发生了根本性的变化，因为目前的药物研发计划从前所未有的化学空间产生了具有罕见物理化学性质的化合物(gydF4y2Ba屠等人，2013gydF4y2Ba）.非氧化代谢和转运体介导的途径，如正弦摄取或肾和胆汁分泌，通常参与这些化合物的消除。通过使用更全面的体外系统，如原代肝细胞或胞质组分，这些过程可以很大程度上覆盖在谱分析中(gydF4y2BaSahi等人，2010年gydF4y2Ba）.此外，已经开发了静态肝脏清除模型，如扩展清除模型，允许整合单个肝脏体外过程清除来预测人类肝脏药物清除(gydF4y2BaKusuhara和Sugiyama, 2009年gydF4y2Ba；gydF4y2BaCamenisch et al.， 2015gydF4y2Ba）.然而，对于代谢稳定性高的化合物的清除，不能在短期体外检测中进行评估，需要时间和成本密集型异速生长缩放方法(gydF4y2BaHutzler等人，2015年gydF4y2Ba）.在目前的研究中，我们发现肝细胞球形细胞由于其长期稳定性有助于克服这些挑战(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)，即使对于阿哌沙班等肝清除率低的化合物，也能充分耗尽母药(临床CLgydF4y2BahgydF4y2Ba= 0.6 mL / min /公斤)。试验药物卡马西平除外(临床CLgydF4y2BahgydF4y2Ba= 0.11 mL/min/kg)，在孵育7天内未发现明显损失。尽管没有统计学意义，但随着时间的推移，卡马西平的少量消耗被观察到，这可能是由于代谢消除而不是卡马西平的细胞积累，考虑到细胞数量相对于培养基体积较小。例如，即使在高细胞-培养基药物浓度比(Kp)为100的情况下，细胞积累也只能解释0.33%的卡马西平从培养基中消失[基于2.2 μL/10的细胞体积gydF4y2Ba6gydF4y2Ba肝细胞(gydF4y2BaRiede等人，2017年gydF4y2Ba)]。然而，由于化学不稳定性而导致的母体药物耗竭一般不能排除。为了考虑非特异性化合物的损失，可以在肝细胞球体缺失的情况下进行额外的培养，以纠正测试化合物的潜在化学不稳定性。gydF4y2Ba
我们之前证明，球状培养的肝细胞在转录组和蛋白质组水平上维持了参与ADME的重要肝脏基因的表达，包括I期和II期药物代谢酶以及摄取和排出转运蛋白，模拟体内肝组织(gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2017gydF4y2Ba）.尽管目前的研究不包括主要由非p450酶或(限速)转运体介导的渗透性消除的药物，但肝细胞球体有望为此类化合物提供同样准确的肝脏清除预测，使其成为制药公司有吸引力的工具。然而，肝细胞球体在药物发现环境中评估大量化合物代谢稳定性的适用性是有限的，除非能够常规获得适合球体自动形成和处理的机器人平台，以降低检测成本(gydF4y2Balucdon - villarin等人，2020年gydF4y2Ba）.此外，肝细胞球形保留了肝细胞供体的表型和基因型(gydF4y2Ba贝尔等人，2016年gydF4y2Ba)，对于研究特定突变(如多态药物代谢酶)或肝病(gydF4y2Ba普里尔等人，2019年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHurrell等人，2020年gydF4y2Ba）.因此，来自单个供体的肝细胞球状体不能反映群体的多样性，这将需要同时用多个球状体批次筛选药物化合物，而微粒体或肝细胞检测通常分别使用多达50和200个供体的混合材料(gydF4y2Ba泉等人，2017gydF4y2Ba）.虽然肝细胞球形可以由多个供体肝细胞批次产生(gydF4y2BaKermanizadeh等人，2019年gydF4y2Ba)，并不是每个平板肝细胞批都适合生产球形肝细胞，多个供体肝细胞批的使用需要仔细监测，以确保来自所有供体的肝细胞在球形肝细胞中平等合并和存活。由于这些限制，肝细胞球体在药物发现的高通量筛选分析中的应用仍然具有挑战性，然而，当标准体外系统失败时，它们可以被视为低周转的药物化合物的第二级方法。以及对具有复杂酶-转运体相互作用的化合物的表征和其他特制的机理研究。gydF4y2Ba
商业长期体外肝系统用于药代动力学研究的使用不断增加，最常用的是原代人肝细胞与基质细胞的微图共培养(MPCCs)。MPCC系统同样具有长期稳定性，并已成功用于低周转率化合物的IVIVE (gydF4y2Ba陈等人，2013年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHultman等人，2016年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba梅原等，2020年gydF4y2Ba）.这些研究总体上产生了相当的准确性，70%-92%的化合物被预测在3倍偏差内，而我们的球体模型预测86%的化合物在3倍偏差内。然而，必须指出的是，不同研究对化合物的选择是不同的。特别是,gydF4y2BaUmehara等人(2020gydF4y2Ba)包括一组不同的摄取转运体和非P450底物，而我们的化合物组由P450底物组成。为了直接比较肝细胞球形模型和MPCC模型的性能，需要对一组协调的化合物和相同的肝细胞批次进行面对面的比较。类似的，另一项最近的研究gydF4y2BaKanebratt等人(2021gydF4y2Ba)应用肝细胞球体预测低周转化合物的清除率。尽管引入了额外的经验标度因子来解释系统性的预测不足，但他们的研究实现了较少的准确预测，AFE和AAFE值分别为0.53和2.7，而我们的研究在没有使用经验标度因子的情况下，AFE和AAFE值分别为0.57和1.74。此外，本研究由gydF4y2BaKanebratt等人(2021gydF4y2Ba)表明，对于清除率较高的化合物，其清除率预测值与实际清除率之间的偏差趋势更明显，而这在我们的研究中并不明显。有趣的是，作者在每次孵育中汇集了三个球体，以增加代谢能力，并观察到可比较的CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba数据使用汇集和单个肝细胞球体。我们试图改善细胞与培养基的体积比，可显著降低CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba集合球体中的值(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba）.对池化球体效果的随访调查显示，单个球体在24-48小时内合并，同时白蛋白分泌减少，主要肝脏药物代谢酶和摄取转运体mRNA表达减少，CYP3A4蛋白表达减少(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba）.球体的融合可能引起细胞结构的重大重排，导致去分化和肝细胞表型的完全丧失。我们没有研究肝细胞表型是否随时间逆转(如正常球状形成时)，然而，融合球状结构中心的肝细胞可能由于球状直径更大而无法获得足够的氧气和营养(gydF4y2BaLin and Chang, 2008gydF4y2Ba)，并且容易受到细胞早期死亡的影响。因此，我们建议避免汇集球体，但执行与单个球体的长期孵育，以充分耗尽母药物。作为一种替代方案，可考虑采用集成微孔板(gydF4y2BaWassmer等人，2020年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba
我们模型的良好性能可能是由于肝细胞球形细胞能够以体内速率连续分泌白蛋白(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba）.培养基中白蛋白(或其他蛋白质)的存在被认为支持细胞摄取，这一过程称为蛋白质介导摄取。潜在的机制尚未完全理解，目前的假说已在其他地方进行了详细回顾(gydF4y2BaBowman和Benet, 2018年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBteich等人，2019年gydF4y2Ba）.不同意自由药物假说(gydF4y2Ba庞和罗兰，1977年gydF4y2Ba)，不同的研究观察到，考虑到未结合药物浓度时，在血浆蛋白存在的情况下，细胞摄取率低于预期，而对于血浆蛋白结合程度较高的化合物，这种效应有所增加(gydF4y2Ba宫内等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba波林和哈达德，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBowman等人，2019年gydF4y2Ba）.此外，据报道，体外方法对药物清除的预测不足与血浆蛋白结合程度成正比(gydF4y2Ba梁等人，2020gydF4y2Ba）.与这些观察结果一致，最近一项应用MPCC的研究报告了高白蛋白分泌率的肝细胞供体的清除预测(gydF4y2Ba达-席尔瓦等人，2018年gydF4y2Ba)，很可能MPCC和球形模型都受益于整合白蛋白分泌。另一方面，随着时间的推移，白蛋白浓度的增加使固有清除率的估计复杂化，因为在培养过程中，介质中药物的未结合部分发生了变化。在本研究中，假设培养基中完全没有蛋白质，在应用给药溶液后不久，从测定板上清液中测定培养基中初始非结合药物浓度。7天后观察到培养基中的白蛋白浓度非常低，研究化合物的血浆蛋白结合度相当小(血浆中未结合的比例≥0.05)，gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)，白蛋白对培养基中未结合的部分无影响，获得CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba对我们的数据集进行估计。为了解释具有大量血浆蛋白结合的药物白蛋白的时间依赖性增加，可以用未结合的白蛋白浓度(使用血浆蛋白结合数据估算)对培养基中测量的药物浓度进行校正。gydF4y2Ba
总之，我们证明，在没有培养基变化的情况下，初级人肝细胞球形细胞在长达7天内表型保持稳定，允许延长培养时间，从而准确预测低至中度肝清除率的药物化合物的肝清除率。肝细胞球形是一种有价值的IVIVE工具，有望显著促进慢代谢化合物的表征，从而在药物开发过程中改善IVIVE。gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
作者要感谢Vlasia Kastrinou-Lampou的实验支持，以及Birk Poller博士对这份手稿的批判性评论。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
参与研究设计：gydF4y2BaRiede, Wollmann, Molden, Ingelman-Sundberg。gydF4y2Ba
进行实验:gydF4y2BaRiede Wollmann。gydF4y2Ba
执行数据分析:gydF4y2BaRiede Wollmann。gydF4y2Ba
手稿的写的或对手稿的写作有贡献的:gydF4y2BaRiede, Wollmann, Molden, Ingelman-Sundberg。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2020年12月21日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2021年4月15日。gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba目前所属机构:PK Sciences，诺华生物医学研究所，巴塞尔，瑞士。gydF4y2Ba
这项工作得到了瑞典癌症协会[授权协议17 0599]、欧洲研究理事会(ERC) -高级授权(AdG)项目HEPASPHER[授权协议742020]和欧盟地平线2020研究和创新计划[授权协议668353/U-PGx]的资助。gydF4y2Ba
没有作者对本研究有任何利益冲突声明。gydF4y2Ba
https://dx.doi.org/10.1124/dmd.120.000340gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
↵gydF4y2Ba
本文的补充资料可在gydF4y2Bawww.3tejia.comgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
缩写gydF4y2Ba
- 美国陆军和空军交易服务处gydF4y2Ba
- 绝对平均折叠误差gydF4y2Ba
- ADMEgydF4y2Ba
- 吸收、分布、代谢和排泄gydF4y2Ba
- AFEgydF4y2Ba
- 平均折叠错误gydF4y2Ba
- CLgydF4y2BahgydF4y2Ba
- 肝器官间隙gydF4y2Ba
- CLgydF4y2BaintgydF4y2Ba
- 内在的间隙gydF4y2Ba
- EgydF4y2BahgydF4y2Ba
- 肝提取比例gydF4y2Ba
- IVIVEgydF4y2Ba
- 体内外推法gydF4y2Ba
- MPCCgydF4y2Ba
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在这个问题上gydF4y2Ba
![Hepatocyte spheroids remain viable and functional during extended incubations. (A) Bright-field images of hepatocyte spheroids from donor A over the time course of 7 days. (B) Media concentration of albumin secreted by hepatocyte spheroids over 7 days. Data points represent mean values of quadruplicates ± S.D. The dashed line represents the albumin secretion rate in vivo [17.8 pg/hepatocyte/day (Jang et al., 2015)]. Δ, donor A; Ο, donor B; ⋄, donor C.](http://www.3tejia.com/content/dmd/49/7/501/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
![Loss of hepatocellular phenotype in pooled hepatocyte spheroids. (A) Bright-field images of pooled hepatocyte spheroids from donor B over the time course of 7 days. (B) Albumin secretion of pooled hepatocyte spheroids over 7 days. Data points represent mean values of quadruplicates ± S.D. The dashed line represents the albumin secretion rate in vivo [17.8 pg/hepatocyte/day (Jang et al., 2015)]. (C) Cellular viability (total cellular ATP) of pooled hepatocyte spheroids over 7 days. Data points represent mean values of quadruplicates ± S.D. Δ, donor A; Ο, donor B; ⋄, donor C. (D) Fold change in mRNA expression (relative to day 0) of major hepatic P450 enzymes and uptake transporters in pooled hepatocyte spheroids during 7 days. Data points represent mean values of the measured fold change in mRNA expression in hepatocyte spheroids from donors A, B, C, and D. (E) Western blot of CYP3A4 and vinculin (loading control) in individual and pooled hepatocyte spheroids from donor D during 7 days.](http://www.3tejia.com/content/dmd/49/7/501/F2.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
利用人肝细胞球体进行清除预测gydF4y2Ba
