摘要
KZR-616是一种不可逆的三肽环氧酮基人免疫蛋白酶体选择性抑制剂。抑制免疫蛋白酶体在体外产生抗炎活性，基于在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮动物模型中有前景的治疗活性，KZR-616正被开发用于多种自身免疫和炎症性疾病的潜在治疗。酮环氧化物药效团的存在在先导优化和临床候选筛选期间的药物代谢研究中提出了独特的挑战。亚博体育app本研究进行了彻底和系统的体外和细胞酶代谢和动力学研究，以确定参与KZR-616代谢和消除的主要酶。当暴露于缺乏NADPH的肝微粒体时，KZR-616及其类似物转化为其不活跃的二醇衍生物，具有不同程度的稳定性。在猴子的药代动力学研究中，二醇的形成也被证明是主要的代谢物，并与单个化合物的体外稳定性结果相关。对完整肝细胞的进一步研究表明，KZR-616代谢对微粒体环氧化物水解酶(mEH)抑制剂敏感，但对细胞色素P450 (P450)或可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂不敏感。原代人肝细胞被确定为体外研究中最强大的mEH活性来源。这些发现也表明，KZR-616在体内的暴露不太可能受到P450和sEH抑制剂或诱导剂的共同作用的影响。
意义的声明这项工作对KZR-616及其相关类似物在体外和细胞酶系统中的代谢和动力学进行了全面和系统的研究。所获得的信息可用于先导化合物优化过程中评估新型共价蛋白酶体抑制剂。这些研究也证明了一个与KZR-616和另外两种三肽环氧酮的体内药代动力学相关的可靠的体外测试系统。
简介
通过三种化合物的监管批准，该蛋白酶体已被验证为治疗药物靶点，用于治疗b细胞肿瘤，如多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤(Bross等人，2004年；Kisselev等人，2001；Kisselev等人，2012；Herndon等人，2013；Offidani等，2014；Gentile等人，2015年)．这些化合物包括两类化学物质:可逆硼酸衍生物硼替佐米(VELCADE)和ixazomib (NINLARO)和四肽环氧酮基化合物carfilzomib (Kyprolis)。与硼替佐米和ixazomib不同，carfilzomib是新一代不可逆抑制剂中的第一个，该抑制剂以蛋白酶体亚基为目标，具有长时间抑制和高选择性(Demo等人，2007年；Kuhn等人，2007年；Zhou等，2009；Arastu-Kapur等，2011；哈什巴尔等人，2015)．随着三种获批药物的成功验证，下一代蛋白酶体抑制剂现在是用于其他疾病研究的一类重要药物(Teicher和Tomaszewski, 2015年)．
免疫蛋白酶体是蛋白酶体的一种独特形式，主要表达于免疫效应细胞(米勒等人，2013)．免疫蛋白酶体通过存在三个不同的催化亚基将自己区别于普遍表达的构成性蛋白酶体:低分子质量多肽(LMP) 7、LMP2和多催化内肽酶复合物样1。这些活性位点亚基也可以在非免疫细胞暴露于炎症细胞因子(如肿瘤坏死因子)时被诱导α(肿瘤坏死因子-α)或干扰素γ（费林顿和格雷森，2012年)．选择性抑制免疫蛋白酶体导致免疫效应细胞的炎症细胞因子减少，并可阻止几种自身免疫性疾病的动物模型的疾病进展，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮(SLE) (Puttaparthi和Elliott, 2005年；Egerer等人，2006年；Groettrup等人，2010；Basler和Groettrup, 2012；米勒等人，2013；Basler等，2015)．kzr - 616 (图1)是一种三肽环氧酮，选择性和不可逆地抑制人体免疫蛋白酶体的LMP7和LMP2亚基;经过彻底的药物化学试验(约翰逊等人，2018)．在人外周血单个核细胞中，KZR-616阻断炎症细胞因子的产生，包括TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-6和白细胞介素-23。在淋巴细胞中，t细胞产生干扰素γ肿瘤坏死因子-αKZR-616抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和活化b细胞向浆母细胞的分化(Muchamuel等，2017)．最后，在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的小鼠模型中，KZR-616以良好的耐受剂量阻断疾病进展，而不影响正常的t细胞依赖性免疫反应(Muchamuel等，2017；约翰逊等人，2018)．KZR-616目前正在SLE和狼疮肾炎患者的二期临床试验中进行评估。
KZR-616, KZR-59177, KZR-59240及其二醇衍生物，carfilzomib和oprozomib的化学结构。
和carfilzomib一样，KZR-616是一种精细的化学选择性，不可逆的n端苏氨酸蛋白酶共价抑制剂，这类蛋白酶的蛋白酶体活性位点亚基几乎是专属的(Kisselev等人，2012)．尽管硼酸为基础的蛋白酶体抑制剂被证明有一个主要的代谢途径，包括通过经典的1期细胞色素P450 (P450)酶进行氧化，carfilzomib被认为是通过肽酶裂解和环氧化物水解为不活跃的二醇在肝外被清除(Yang等，2011；王等人，2013)．Oprozomib是carfilzomib的三肽环氧酮类似物，目前正在多发性骨髓瘤的临床研究中，被证明是微粒体环氧化物水解酶(mEH)的底物(王等，2017)．鉴于KZR-616与carfilzomib和oprozomib在结构上的相似性，我们的目标是在开始慢性疾病的临床试验之前确定参与KZR-616代谢的主要和特定的代谢途径和酶。此外，通过进行彻底和有方法的体外实验方法，并评估大型动物体内的药代动力学，我们能够进行体外到体内外推相关性，以确定哪种替代物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)体外模型系统对新型环氧酮临床候选药物的开发最有价值。
材料和方法
材料和细胞生长条件。
所有化学品和试剂均来自Sigma(圣路易斯，密苏里州)，液相色谱[质谱(MS)级]溶剂均来自Fisher科学(匹兹堡，宾夕法尼亚州)。KZR-616，氘KZR-616 (d8-KZR-616)、KZR-59587、KZR-59177、KZR-59240和KZR-616类似物在Kezar生命科学公司合成。2-2-壬基磺酰丙酰胺(NSPA)、人类重组mEH和可溶性环氧水解酶(sEH)是来自加州大学戴维斯分校Bruce Hammock实验室的礼物。Newman等人，2003年；Morisseau等人，2008年；Montellano 2018)．从Sigma中得到1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)尿素(TPPU)和1-氨基苯并三唑(1-ABT)。肝亚细胞组分，包括公猴或母猴肝微粒体(共6个;20 mg/ml)，细胞质(6个池;10 mg/ml)，人肝亚细胞组分，包括男性或女性肝微粒体(池10,20 mg/ml)，细胞质(混合性别;池50,10 mg/ml)、人类冷冻保存肝细胞池(100个供体，男女混合)和培养基(K8400)、猴冷冻保存肝细胞(5个雄性食蟹猴供体，PPCH 2000)和培养基(20-1-0526)从Sekisui Xenotech(堪萨斯城，KS)购买。人肝细胞在37°C, 95%空气/5% CO的环境中培养2．
NADPH存在和不存在时肝脏微粒体的代谢稳定性。
在含有或不含NADPH的人(H)和猴(M)肝脏微粒体(lm)中评估反应。在含有3.3 mM MgCl的0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中，将测试化合物和探针底物与含有或不含1.2 mM NADPH的HLM (0.5 mg/ml)和MLM (0.25 mg/ml)混合2．混合物保持在37°C长达60分钟，在指定的时间点通过加入两体积的含0.1%甲酸(FA)和25 nM内标(IS) d的乙腈终止反应8kzr - 616。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)或液相色谱-紫外检测(LC-UV)方法监测被测化合物及其二醇代谢物和探针底物代谢物的消失情况，如下所述。每个实验反应都进行了三次重复。固有间隙(Clint)以亲本化合物消失率表示。睾酮(50 μ M)和独联体对称二苯代乙烯氧化物(所以;50 μ M)分别作为P450和mEH的探针底物。
猴肝细胞代谢稳定性研究。
冷冻保存的猴子肝细胞被解冻并重新悬浮在培养基中。KZR-59177、KZR-616和KZR-59240 (1 μ M)和参考底物(50 μ M睾酮，独联体所以,反式-SO)与猴肝细胞(0.25 × 106细胞/ml)在37°C, 95%空气和5% CO的细胞培养箱中2了40分钟。在不同的时间点通过加入两体积的含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈来终止反应8kzr - 616。样品离心，KZR-616, KZR-59177, KZR-59240;二醇代谢物KZR-59587、KZR-59165和KZR-59433;用LC-MS/MS和LC-UV对探针底物的代谢物进行定量，定量方法如下。睾丸素(50µM),独联体-SO (50 μ M)，和反式-SO(50µM)分别作为P450和环氧化物水解酶(EH)的探针底物。
P450 LM表型。
KZR-616在没有或存在已知的六种主要P450亚型的化学抑制剂的HLMs中孵育:呋喃酰基(CYP1A2, 10µM)、孟鲁司特(CYP2C8, 5µM)、磺胺唑(CYP2C9, 5µM)、苄涅醇(CYP2C19, 1µM)、喹尼定(CYP2D6, 1µM)和酮康唑(CYP3A4/5µM)。反应混合物包含最终浓度的1µM KZR-616, 0.2 mg/ml HLM蛋白和1 mM NADPH，在100 mM磷酸钾(pH 7.4)缓冲液中加入3.3 mM MgCl2．以KZR-616在孵育15和30分钟后与0分钟对照反应孵育的消失程度计算其代谢程度。同时监测了KZR-59587 (KZR-616二醇)的形成。
肝微粒体绑定。
将MLMs (0.25 mg/ml)和HLMs (0.5 mg/ml)分别用50µM的NSPA在0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中预孵育10分钟，然后加入终浓度为1µM的KZR-616、KZR-59177、KZR-59240和氯丙嗪(对照)，37℃孵育30分钟。孵育液在37℃，85000 rpm离心4小时，等量(30µl)的上清加入等体积的无化合物空白LM残液，等量(30µl)的LM残液加入等体积的无化合物空白上清液。样品用150 μ l含0.1% FA的乙腈/甲醇(1:1)内标溶液淬火。离心后，所有样品上清液进行LC-MS/MS分析。试验化合物与蛋白质结合的百分比由下式计算:% Free =(试验化合物在上清液中的浓度/试验化合物在LM残液中的浓度)× 100%;%束缚测试化合物= 100%−%游离
血浆蛋白结合。
KZR-616与食蟹猴血浆结合采用平衡透析。缓冲腔中加入350µl磷酸盐缓冲液(pH7.4)， 5µM KZR-616和对照(phenacetine;奎尼丁和华法林)到红方。封板，在37°C, 100转/分的轨道激振器上孵育5小时。将50µl的血浆样品(来自红色侧)与50µl的空白缓冲液混合，50µl的缓冲样品(来自缓冲室)与50µl的空白血浆混合，制备重复分析样品。样品用150 μ l含0.1% FA的乙腈/甲醇(1:1)内标溶液淬火。离心后，所有样品上清液进行LC-MS/MS分析。
药物动力学的猴子。
所有动物研究均按照美国国立卫生研究院所通过及颁布的《实验动物护理及使用指南》进行，并获该机构的动物护理及使用委员会或当地同等机构(实验动物资源研究所，1996年)．KZR-616、KZR-59177和KZR-59240分别给食蟹猴皮下给药。共16只雄性，non-naïve，和未禁食的动物被随机分为三组(每组4只)，接受剂量为3 mg/kg的10%聚山梨酯(PS-80)水溶液的测试化合物。在给药前、给药后2、5、10、20和30分钟以及给药后1、2、4、8和24小时采集血液样本。血浆样品在4°C下3000rpm离心5分钟获得。血浆样品加入三体积含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈进行淬火8kzr - 616。通过LC-MS/MS定量母质和二醇代谢物水平，如下所示。
重组人EH代谢。
在0.1 M Tris-HCl缓冲液中对含0.1 mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的mEH (pH 9.0)和sEH (pH 7.5)进行反应。一系列酶孵育液在37℃预热5分钟，然后加入1µM carfilzomib或KZR-616。mEH的酶浓度分别为2、4、8、10 μ g/ml, sEH的酶浓度分别为1、10、25、50、100 μ g/ml。60分钟后，通过加入两体积含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈终止反应8kzr - 616。二醇的形成用LC-MS/MS进行定量。反式-SO (50 μ M)和独联体-SO(50µM)分别作为sEH和mEH的探针底物，用LC-UV定量二醇形成，如下所示。
KZR-616在人肝细胞中的代谢谱分析。
将冷冻保存的人肝细胞在细胞培养基中解冻并重新悬浮。含有肝细胞的反应(2 × 106细胞/ml)和KZR-616(10µM)在37°C、95%空气和5% CO的24孔细胞培养板细胞培养基中进行培养2为2小时。通过加入四体积的含0.1% FA的乙腈来终止反应。肝细胞(2 × 106细胞/ml)用四体积的乙腈淬火，然后用KZR-616(10µM)作为对照样品。得到的混合物以4000转/分离心15分钟。上清液在N2用30%乙腈(v/v)对所得残渣进行重组，然后进行LC-MS/MS分析。代谢产物鉴定使用应用生物系统质谱仪(API 4000 QTrap)和Shimadzu LC-20进行。色谱分离使用Kinetex 2.6进行µC18 100A色谱柱(3.0 mm × 50 mm)，流动相(A:含0.1% FA的水;B:含0.1% FA的乙腈)，流速为0.6 ml/min。流动相步长从5%(0.3分钟)增加到95% B(12分钟)。总运行时间为15分钟。
人肝细胞的代谢。
汇集冷冻保存的人肝细胞(0.5 × 106细胞/ml)在含有0.1% DMSO和不同浓度EHs或P450抑制剂的培养基中预培养(10 μ M NSPA, 5分钟;200 μ M TPPU和500 μ M 1-ABT孵育30分钟)，置于37°C、95%空气和5% CO的细胞培养箱中2．预孵育后，KZR-616(1µM)和对照底物(50µM睾酮，独联体所以,反式-SO)分别在有或无(1- abt、NSPA和TPPU)的情况下，在37℃的细胞培养箱中孵育1小时。1、10、20、30、40和60分钟后，通过加入两体积的含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈终止反应8kzr - 616。样品离心，用LC-MS/MS和LC-UV对KZR-616、二醇和参考底物的代谢物进行定量，如下所示。
KZR-616在人血浆中的代谢物分析。
从每周皮下给药KZR-616的SLE患者中收集血浆样本，持续13周(NCT03393013)．我们分析了KZR-616最大给药剂量为75 mg的患者的样本。每个样本的AUC是从四名受试者(110-004、112-021、113-002和116-012)中的一名受试者在第29天的抽血时间点(给药前，0.0833、0.25、0.5、1、2、4、8小时后)收集的。每个血浆样品(400µl)用含0.1% FA的三体积ACN/MeOH(1:1)提取，然后以3000 rpm离心15分钟。每个样品的上清液在氮气流中浓缩，并在含0.1% FA的30% ACN/MeOH(1:1)的200µl中重组。将样品注入液相色谱(LC)-质谱(ms)系统进行分离鉴定。色谱分离使用Waters XBridge C18, 3.0 × 150 mm, 3.5 μ m流动相(a:含0.1% FA的水;B:含0.1% FA的乙腈)，流速为0.8 ml/min。流动相步长从0.3分钟时的3%增加到25分钟时的35% B和26分钟时的90% B。总运行时间为35分钟。 Metabolite identification was conducted using an AB Sciex Triple TOF API6600 mass spectrometer equipped with a Shimadzu Nexera UPLC system. Metabolite structures were assigned based on accurate mass (±5 mDa) determination of a parent ion from a full-scan TOF MS followed by triggered MS/MS fingerprints.
反应动力学。
KZR-616在雌性和雄性HLMs (0.5 mg/ml)和MLMs (0.2 mg/ml)中加入0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)和0.1 mg/ml BSA，在37℃下反应30分钟。在人肝细胞中研究了KZR-616在37℃肝细胞维持培养基中30分钟的动力学。KZR-616在含0.1 mg/ml BSA的0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)中，37℃下，4µg/ml重组人mEH中孵育30分钟，测定反应动力学。预热酶5min后加入KZR-616(0-1000µM)启动反应。为了进行carfilzomib的动力学研究，优化培养并使用2µg/ml预热的重组人mEH在37℃下孵育20分钟，在0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)中含有0.1 mg/ml BSA。
NSPA在女性和男性HLMs (0.5 mg/ml)和MLMs (0.25 mg/ml)，人肝细胞(0.5 × 106细胞/ml)，重组人mEH(4µg/ml)测定IC50使用不同浓度的NSPA (0-100 μ M)在37℃下反应15-30分钟，对KZR-616(10µM)进行检测。在重组人mEH中评估NSPA以确定IC50环氧卡非佐米水解。简单地说，预热的重组人mEH(2µg/ml)与1µM的CFZ在37°C NSPA浓度范围内(0 ~ 10µM)孵育20分钟。通过加入两体积含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈来终止反应8-KZR-616，用LC-MS/MS方法定量KZR-616和carfilzomib的二醇衍生物的浓度。使用非线性回归数据分析(GraphPad Prism 7.04.)将每组数据拟合为一个简单的Michaelis-Menten动力学模型。每个实验反应都是重复进行的。独联体-SO (50 μ M)孵育平行进行，作为阳性对照。
环氧化物水解酶抑制活性。
在LM和重组EH中研究KZR-616对mEH和sEH的体外抑制作用。独联体所以,反式-SO分别作为mEH和sEH的探针底物。为了测试KZR-616作为mEH抑制剂，将预热的池状HLMs (0.5 mg/ml)、MLMs (0.25 mg/ml)和重组mEH(4µg/ml)与之孵育独联体-SO (50 μ M)在反应缓冲液中，在37℃下反应30分钟，没有或存在100 μ M KZR-616。为了研究KZR-616作为sEH抑制剂的作用，将预热的人肝细胞液(0.5 mg/ml)和重组sEH(100µg/ml)与之孵育反式-SO(50µM)分别在含0.1 mg/ml BSA的0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)和含0.1 mg/ml BSA的0.1 M Tris-HCL缓冲液(pH 7.4)中。用两体积的冷乙腈淬火反应，并测定二醇衍生物的浓度独联体所以,反式-SO采用LC-UV法定量，如下所述。
LC-MS/MS和LC-UV定量。
采用配备电喷雾电离源的AB Sciex 5500 Q-Trap质谱计对卡非佐米米、KZR-616、KZR-59177、KZR-59240、P450探针底物(睾酮)及其二醇衍生物进行了LC-MS/MS定量分析。对每一化合物m/z(母>产物离子)使用以下质量过渡多重反应监测:587.4 > 371.2,605.1 > 389.2,571.3 > 389.6,589.7 > 150.1,607.3 > 391.2,719.8 > 402.2,737.9 > 402.2,289.3 > 109.1,305.1 > 269.1,594.9 > 371.2，用于KZR-616, KZR-59587(二醇)，KZR-59177, KZR-59165(二醇)，KZR-59240, KZR-59433(二醇)卡非佐米，睾酮，6β-睾酮和IS d8分别kzr - 616。色谱分离采用YMC-pack pro C18 (3µ(A)水和(B)含0.1% FA的乙腈，流速分别为0.5和1.0 ml/min。流速为0.5 ml/min时，流动相开始于5% B，持续0.5分钟，2.3分钟线性发展到95%乙腈，保持在95% B，持续0.7分钟，0.1分钟返回到5% B。流速为1.0 ml/min时，流动相开始于10% B，持续0.5分钟，随后在1.7分钟内线性上升95%乙腈，保持在95% B，持续0.5分钟，0.1分钟返回到5% B。
量化的独联体所以,反式-SO和相应的代谢物使用LC-30AD系统结合SPD-20AV检测器完成。色谱分离使用Kinetex反相C18 (1.7µ2.1 mm × 50 mm)色谱柱，流动相(A)水和(B)乙腈(含0.1% FA)，流速0.5 ml/min。流动相在10% B浓度下开始1.0分钟，在5分钟内逐渐增加到95%乙腈，在95% B浓度下保持1.0分钟，在0.1分钟后回到10% B浓度。
通过在校准范围内(1-5000 ng/ml)绘制每种化合物与IS (d8-KZR-616)的峰值面积比与每种化合物对应浓度的比值，并通过线性回归方程拟合，建立每种测试化合物的校准曲线。然后使用校准曲线计算每个测试化合物的浓度。
动力学分析与集成电路50数据处理。
通过KZR-616在0 ~ 1000 μ M范围内的重复实验，得到了KZR-616的环氧化物水解动力学。K米和V马克斯通过GraphPad Prism软件将diol (KZR-59587)地层数据拟合到Michaelis-Menten方程中进行计算。集成电路50采用对数(抑制剂)与响应变量斜率的非线性拟合计算。的集成电路50只有当数据处于抑制剂浓度范围内时，才对数据进行验证。
采用GraphPad Prism进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差格式表示。对于动力学和IC5095% CI(置信区间)阈值与拟合优度(R2> 0.99)。
结果
KZR-616及其类似物在肝微粒体和猴肝细胞中的代谢特性。
KZR-616是从一项涉及合成超过400个三肽环氧酮(专利:McMinn D，等。专利申请US9657057B2；专利申请US10647744B2)．为了进一步了解这种化学类型的结构-活性关系，使用HLM和MLM在体外模型系统中评估了79个有效和选择性类似物的一个亚群的代谢稳定性，它们显示出高水平的mEH和P450活性。睾丸激素,独联体所以,反式-SO被用作P450 (补充图1)、mEH和sEH (补充图2),分别。环氧化物水解酶的稳定性在化合物和LM的混合物中进行了评估，在没有NADPH来阻止P450活性的情况下。所示图2一个在HLM和MLM的培养中，79种被测试化合物的环氧水解稳定性都有很大范围。选择KZR-616、KZR-59177(不稳定模拟物)和KZR-59240(稳定模拟物)作为工具化合物，探索p450介导的LM代谢途径。在LM培养中，随着NADPH的加入，KZR-616、KZR-59177和KZR-59240的内在清除率显著增加，提示P450酶在该实验体系中起主导作用(表1)．
(A)缺乏NADPH时KZR-616及其类似物在人和猴肝脏微粒体中的代谢。在没有NADPH的HLMs (0.5 mg/ml)或MLMs (0.25 mg/ml)中检测到残留KZR-616、KZR-59177和KZR-59240以及总共79种类似物的百分比。KZR-616及其类似物的初始浓度为1µM。用LC-MS/MS测定KZR-616及其类似物的残留浓度。数据以三次孵育的平均值±标准差表示。(B) KZR-616及其类似物在猴肝细胞中的代谢。KZR-616, KZR-59177和KZR-59240在猴肝细胞中残留的百分比和它们的二醇形成的初始亲(0.25 × 106细胞/ml)孵育40分钟。母粒初始浓度为1µM。用LC-MS/MS分析测定亲本及其二元醇的浓度。重复孵育的数据以平均值±标准差表示。
在存在或不存在NADPH的HLMs和MLMs中KZR-616及其类似物的体外代谢稳定性
预测t1／2和Clint均由体外实验获得。数据以平均值±表示
s.d (n = 3)。所测化合物的含量为1µM。用超离心法测定被试化合物的LM结合率(%)。
我们接下来确定了微粒体结合对三种测试化合物的内在清除率的影响。猴子和人类LM混合物中KZR-616的%界平均值分别为7.4%和12.3%，KZR-59240的%界平均值为21.3%和20.4%。KZR-59177的%界限平均值不适用，因为LM混合物的稳定性问题导致%界限值为负。总的来说，KZR-616和KZR-59240之间的%界限值在人类和猴子的LM中差异很小，因此，KZR-616和KZR-59240 (表1)是可靠的。
为了评估这三种化合物的代谢稳定性，我们还选择了使用猴肝细胞的细胞基体外模型，该模型显示出高水平的mEH和P450活性。所示图2 b采用合成标准对KZR-59177、KZR-616和KZR-59240及其二醇形成物的消失度进行定量分析。KZR-59177、KZR-616和KZR-59240在孵育40分钟后，亲本回收率分别为82.0、96.4和100%。这些定量结果表明，环氧化物水解是三种工具化合物在猴肝细胞中的主要代谢途径。
P450表型分析表明，CYP3A4/5是参与KZR-616微粒体代谢的主要酶，CYP2C8在其代谢中起次要作用。KZR-616二醇，KZR-59587的形成不受P450抑制剂的影响，这表明其他酶，如环氧化物水解酶，在二醇的形成中起着重要作用(补充表1)．
KZR-616, KZR-59177和KZR-59240在猴子体内的药代动力学。
考虑到体外代谢稳定性的明显差异，我们接下来研究了KZR-616, KZR-59177和KZR-59240在食蟹猴体内的药代动力学(PK)，单次皮下给药3 mg/kg。所示表2，总暴露量(从0到无穷曲线下的面积，AUC正)以KZR-59240最高，其次是KZR-616和KZR-59177。KZR-616、KZR-59177和KZR-59240的AUC (diol: parent)分别为3.40±0.81、3.35±1.20和0.78±0.46。各化合物的亲本和二醇的PK与无NADPH的MLM中P450酶未被激活的稳定性结果一致。有趣的是，KZR-59240在体外对二醇形成具有抗性，在猴子体内产生了显著的二醇形成水平(二醇/亲本的AUC比:0.78±0.46)。
人类mEH和sEH对KZR-616环氧化合物水解的影响。
KZR-616在结构上与carfilzomib相关，carfilzomib在体内也被代谢为不活跃的二醇(表2)．由于环氧水解被确定为KZR-616在体内的主要代谢途径，我们利用重组酶评估了mEH和sEH对KZR-616和carfilzomib的二醇形成的贡献。KZR-616 (图3)和carfilzomib (图3 b)随着mEH从2µg/ml增加到10µg/ml而增加，但在重组sEH存在到200µg/ml时，两种化合物均未检测到显著的二醇衍生物。还研究了KZR-616在人类和猴肝脏微粒体(含mEH)和肝细胞质(含sEH)中的环氧水解。探针底物独联体-SO (50 μ M)和反式-SO(50µM)分别作为mEH和sEH活性的对照(补充图2)．与使用重组酶的结果相似，二醇的形成随着肝微粒体浓度的增加而增加，但与肝细胞质孵育时二醇的形成很少(图3、C和D)．综上所述，这些数据表明KZR-616和carfilzomib的环氧化物水解主要是由mEH介导的，而sEH在这些化合物的代谢中几乎没有作用。
KZR-616和carfilzomib在重组mEH和sEH中的环氧水解KZR-616在HLMs、MLMs、人和猴细胞质中的环氧水解。(A) KZR-616在重组人mEH(2-10µg/ml)和sEH(20-100µg/ml)中的环氧水解。(B) carfilzomib (CFZ)在重组人mEH(2-10µg/ml)和sEH(20-200µg/ml)中的环氧水解。(C) KZR-616在HLM (0.25-1 mg/ml)和人细胞质(0.4-1 mg/ml)中的环氧水解。(D) KZR-616在MLM (0.2-1 mg/ml)和猴细胞液(0.1-1 mg/ml)中的环氧水解。用LC-MS/MS测定KZR-616、carfilzomib及其二醇的浓度。数据以三次孵育的平均值±标准差表示。
KZR-616在人肝细胞和血浆中的代谢。
接下来，我们定量评估了KZR-616的消失和KZR-59587和其他代谢物在人肝细胞中的形成。KZR-616暴露2小时后鉴定出的代谢物如图4-3A所示。在该体系中，直接环氧水解是KZR-616的主要途径。只检测到微量的额外代谢物，包括去甲基化和氧化，以及氧化和环氧化物水解的结合。各代谢物的MS/MS谱显示在图4 - 1．
所鉴定的代谢物的MS/MS谱。代谢产物在人肝细胞(2.0 × 106细胞/毫升)。(4-2) KZR-616在人肝细胞中的代谢及1-ABT、NSPA和TPPU的作用。(A)在1-ABT存在或不存在的情况下，KZR-616残留在人肝细胞中的百分比。(B)在1-ABT存在或不存在的情况下，人肝细胞中形成二醇KZR-59587。(C)在NSPA和TPPU存在或不存在的情况下，KZR-616残留在人肝细胞中的百分比。(D)在NSPA和TPPU存在或不存在时，人肝细胞中KZR-59587二醇的形成。冷冻培养的人肝细胞浓度为0.5 × 106细胞/毫升。KZR-616的初始浓度为1µM。1-ABT、NSPA和TPPU的抑制剂浓度分别为0.5 mM、10 μ M和200 μ M。采用LC-MS/MS法定量KZR-616和KZR-59587的浓度。重复孵育的数据以平均值±标准差表示。(4-3) KZR-616在人肝细胞和血浆中的代谢途径。(4-3A) KZR-616(10µM)暴露于冷冻保存的人肝细胞池(2 × 106细胞/ml) 2小时。(4-3B) 4名接受75mg KZR-616剂量的患者(剂量后0-8小时)的人血浆中代谢物的鉴定。
我们使用1-ABT(一种泛p450抑制剂)、NSPA(一种mEH抑制剂)和TPPU(一种sEH抑制剂)来评估这些代谢途径。抑制P450后，KZR-616的内在间隙值为16.5±0.306和18.6±0.400 μ l/min/10，无差异(图4-2)6细胞在1-ABT存在和不存在的情况下。KZR-616和二醇的回收率在60分钟内达到100%左右。同样，当TPPU浓度达到200 μ M时，对KZR-616的去除和二醇的形成没有影响。相比之下，NSPA既影响母体的丢失，也影响二醇的形成，这表明mEH在人肝细胞中KZR-616的代谢中起着主要作用。
从四名接受75mg KZR-616剂量的患者(剂量后0-8小时)的人血浆中鉴定出的代谢物如图4-3B所示。KZR-59587(二醇)被鉴定为主要代谢物。以KZR-59587及其亲本KZR-616的峰面积占KZR-616总峰面积的百分比进行量化，观察到的代谢产物分别为33.8和61.2;45.8和49.0;47.9和46.5;4例患者分别为43.8和51.8 (表4)．其他代谢物，包括KZR-59587的异构体，KZR-616的氧化、水解、脱氢和双氧化，均小于KZR-616和代谢物总峰面积的1%。
KZR-616环氧化合物水解动力学。
接下来，我们使用重组人mEH、HLMs和人肝细胞在KZR-616浓度的大范围内(0-1000 μ M)测定了二醇形成的反应动力学(图5,5 b)．采用优化的酶浓度和孵育时间，以确保初始的meh介导水解在精确估计的线性产物形成范围内(图6)．对KZR-616环氧水解的抑制作用独联体- NSPA的so是并行评估的。NSPA抑制meh介导的KZR-616的水解，平均IC50在不同的测试系统中，值从0.409到0.826µM (图7)．从这些实验中，我们能够得到动力学常数(K米)，最大速度(V马克斯)和效率(V马克斯/ K米)的环氧化物水解(表3)．如预期的那样，重组mEH的代谢效率最高。重组人/雄、猴肝脏微粒体的代谢效率分别为重组mEH的0.33% ~ 0.45%和4.5% ~ 4.6%，表明重组人/雄、猴肝脏微粒体的mEH水平较MLMs低。
KZR-616在HLMs、MLMs、重组人mEHs和人肝细胞中的环氧水解动力学。(A)在37°C 30分钟内，二醇KZR-59587在雄性和雌性HLMs、MLMs和重组人mEHs中形成的动力学。(B) 37°C 30分钟KZR-59587在人肝细胞中形成的动力学。K米和V马克斯通过将曲线拟合到Michaelis-Menten方程来估计值。数据为重复孵育的平均值±标准差。
NSPA对HLMs、MLMs、人肝细胞和重组人mEHs中KZR-616环氧水解的抑制作用(A) NSPA对雌雄HLMs中mEH活性的抑制作用。(B) NSPA对雄性和雌性传代虫mEH活性的抑制作用。(C) NSPA对人肝细胞mEH活性的抑制作用。(D) NSPA对重组人mEH中mEH活性的抑制。的集成电路50用非线性回归数据分析估计数值。重复孵育的数据以平均值±标准差表示。
探针底物对环氧化物水解的抑制作用独联体所以,反式所以通过kzr - 616。(一)方案独联体-SO代谢和抑制独联体-SO水解KZR-616。(B)方案反式-SO代谢和抑制反式-SO水解KZR-616。二醇衍生物独联体所以,反式- (R，R采用LC-UV法对-羟基安息香和中odro安息香进行定量分析。
最后，我们试图确定KZR-616是否可以抑制重组酶、lm或完整细胞中的EH活性。环氧化物水解的独联体-SO由mEH和环氧化物水解而成反式-SO不受KZR-616在100 μ M浓度下的存在影响(图)。
讨论
与传统可逆抑制剂相比，靶向共价抑制剂有几个优点，包括提高疗效和选择性(Leung等，2017)．肽环氧酮基蛋白酶体抑制剂，如carfilzomib和oprozomib，尽管在体内快速清除和短时间全身暴露，但由于蛋白酶体活性位点的共价修饰(Yang等，2011；王等人，2013)．这些化合物主要通过环氧化物水解代谢为不活跃的二醇，使分子不活跃。由于这种非传统的代谢途径，目前还没有很好的体外测试系统来研究这类化合物的代谢特性。KZR-616是一种新型的环氧酮肽，旨在选择性结合免疫蛋白酶体活性位点LMP7和LMP2，目前正在自身免疫性疾病的2期临床试验中进行评估。约翰逊等人，2018)．我们在多个体外测试系统中研究了KZR-616及其类似物，从重组酶到活细胞培养，并将这些数据与给药给非人类灵长类动物后的清除率进行比较，以努力确定未来药物化学运动的最佳体外测试系统。
在这项工作中，我们试图开发ADME分析，可用于筛选不可逆共价蛋白酶抑制剂。在药物研发阶段，我们遇到的一个挑战是找到一个与体内PK结果相关联的最佳体外测试系统。三种工具化合物(KZR-616, KZR-59177和KZR-59240)被用于研究它们在人和猴肝脏微粒体(LMs)中存在和不存在NADPH的代谢稳定性。我们发现Clint在有NADPH的情况下，这些化合物的代谢主要由P450 + EH驱动，而在没有NADPH的情况下，仅由EH驱动，并且在有NADPH的情况下，CYP3A4/5是驱动LM中P450代谢的主要亚型。然而，PK数据显示，它们的二醇衍生物是主要的代谢产物，表明mEH在体内发挥主要作用，p450介导的代谢不参与。这意味着体外LM测试系统不会产生相关的或指示性的代谢结果。
通过对猴肝细胞的研究，我们发现这些化合物的主要代谢产物是二醇衍生物，说明mEH在肝细胞系统中起主要作用，并与PK结果相关。在人肝细胞中进一步研究临床候选KZR-616。KZR-616在人肝细胞中的代谢谱分析表明，mEH代谢途径产生的二醇KZR-59587是KZR-616的主要代谢物，只有少量的氧化和脱氢代谢途径产生的其他代谢物。使用P450和EHs抑制剂研究人肝细胞中KZR-616的代谢，也得出meh介导的代谢是主要途径。与猴子系统相似，从接受KZR-616治疗的患者中提取的人类血浆样本的代谢分析显示，二醇KZR-59587是主要代谢物。其他代谢物均小于母体和观察代谢物总量的1%。因此，在体外和体内的猴子系统都可以预测KZR-616在人体内的ADME特性。
肝微粒体是一种广泛用于先导化合物发现项目中高通量ADME筛选的体外测试系统。然而，最近报道了与体内研究结果相关的担忧和对P450活性的高估(廷格尔和赫尔斯比，2006年；布朗等人，2007年)．在LM制剂中P450活性的必要辅助因子NADPH存在的情况下，KZR-616及其类似物被迅速清除，但母体和二醇的回收率很低(1小时内约50%)，表明有其他代谢途径参与。然而，在没有NADPH的情况下，在79种相关化合物中观察到不同程度的稳定性。在给猴子服用KZR-616和其他两种结构相关的化合物后，发现二醇产物也是主要代谢物。在体内测量的这些化合物的PK暴露与观察到的在没有NADPH的LM培养的稳定性有很好的相关性。有趣的是，KZR-59240在LM培养中是稳定的，显示出最小的二醇形成，在体内测量了二醇代谢物(KZR-59433)的显著形成。从没有NADPH的标准LM培养中检测到的代谢物与体内药代动力学研究之间的差异表明，EH酶活性可能在微粒制备过程中丢失或在LM测试系统中被其他酶抑制。
为了克服使用LM研究肽环氧酮代谢的主要不足，我们使用低温保存的人肝细胞作为体外测试系统。完整的肝细胞包含I期和II期代谢酶，可能提供一个更全面的系统来关联体外测试结果与体内PK (McGinnity等人，2004年；Newman JW等人，2005；布朗等人，2007年)．与PK研究中观察到的相似，KZR-616与完整的肝细胞孵育后发现的主要代谢物是二醇。正如使用酶特异性探针底物所证明的那样，肝细胞同时含有sEH和mEH，我们使用异构体特异性抑制剂对KZR-616代谢进行表型分析。mEH抑制剂NSPA阻断了二醇的形成，但TPPU(一种sEH抑制剂)和ABT-1(一种pan-P450抑制剂)对二醇的形成或母化合物的损失都没有影响。因此，使用人类肝细胞，我们能够匹配在体内看到的代谢物轮廓，并确定负责KZR-616中二醇形成的特定酶。
环氧化物水解酶是一种在哺乳动物中普遍表达的酶家族(de Waziers等人，1990年；Enayetallah等人，2006年；Morisseau 2013；Gautheron和Jéru, 2020年)，是含有环氧化合物残渣的化合物解毒的主要途径(德克尔等，2009年；Kitteringham等人，1996年)．主要有两种亚型:由EPHX1基因编码的mEH (Hartsfield等人，1998年；克尔等人，1989年；Vaclavikova et al.， 2015)，主要定位于内质网和sEH，由EPHX2基因编码，主要局限于细胞质(Larsson等人，1995年)．两者都在哺乳动物肝细胞中高度表达(吉尔和吊床，1980年；科勒等，2001年)．利用人肝细胞，我们确定mEH是KZR-616及其类似物的主要酶介导代谢。用重组酶、LMs和完整细胞测定了KZR-616环氧化物水解的酶动力学常数。这些研究表明，eh介导的LM代谢效率小于重组酶的5%，肝细胞是一个更有效的环氧化合物水解细胞系统。考虑到mEH也介导carfilzomib和oprozomib的代谢，这代表了这类化合物的一个共同代谢途径。值得注意的是，与KZR-616不同，carfilzomib和oprozomib在体内都显示肽酶水解作为额外的代谢途径(王等人，2013；王等，2017)．同样有趣的是，CFZ和KZR-616在猴子体内的体外血浆稳定性研究(未发表数据)在37°C下6小时没有产生任何肽裂解代谢物，环氧化物水解代谢物(二醇)低于这两种化合物的定量限制，表明商业猴子血浆中同时缺乏肽酶和mEH。
综上所述，通过对体外试验系统的深入分析和药代动力学数据的分析，确定了KZR-616的主要代谢途径为mEH作用下的环氧化物水解。这些数据表明，KZR-616的PK不太可能受到P450和sEH抑制剂/诱变剂的共同作用的影响，而且KZR-616不太可能改变其他mEH和sEH底物药物的环氧水解。鉴于KZR-616代谢的广泛组织分布和重组酶测定的效率，很难在体内饱和这一过程。这表明，在同时服用已知或疑似的mEH抑制剂后，改变KZR-616暴露的风险很低。
这里介绍的工作描述了一系列体外和细胞为基础的肽类环氧酮类似物的酶代谢和动力学研究。尽管有一些描述的局限性，肝细胞作为一个很好的体外测试系统来评估KZR-616和其他肽环氧酮的代谢谱，并可以在先导化合物优化过程中评估新型共价蛋白酶体抑制剂。
致谢
我们感谢来自Kezar生命科学的Celia Economides, Kiruthi Palaniswamy, Michelle Greenman和Mark Shiller对手稿的审阅和有益的建议。
作者的贡献
参与研究设计:方,柯克,王。
进行实验:方，约翰逊，安德尔，穆查缪尔，麦克明，王。
贡献了新的试剂或分析工具:Morisseau,吊床。
执行数据分析:方,王。
撰写或参与撰写手稿的:方，莫里索，吊床，柯克，王。
脚注
- 收到了2020年的11月9日。
- 接受2021年6月24日。
↵1目前隶属机构:加州大学戴维斯分校。
这项研究得到了凯泽生命科学公司的支持。
作者声明他们没有竞争利益。
↵
这篇文章有补充材料可在www.3tejia.com．
缩写
- 1-ABT
- 1-aminobenzotriazole
- ADME
- 吸收，分配，代谢和排泄
- AUC
- 曲线下面积
- BSA
- 牛血清白蛋白
- Clint
- 内在的间隙
- d8kzr - 616
- 氘kzr - 616
- 嗯
- 环氧化物水解酶
- 足总
- 甲酸
- H
- 人类
- 高级别
- 人类的肝脏微粒体
- 是
- 内部标准
- 信用证
- 液相色谱法
- 质/女士
- LC串联质谱法
- LC-UV
- 紫外检测LC
- LM
- 肝微粒体
- LMP
- low-molecular-mass多肽
- 米
- 猴子
- 咩
- 微粒体环氧化物水解酶
- 传销
- 猴肝微粒体
- 女士
- 质谱分析
- NSPA
- 2-nonylsulfanyl-propionamide
- P450
- 细胞色素P450
- PK
- 药物动力学
- 医师
- 可溶性环氧化物水解酶
- 系统性红斑狼疮
- 系统性红斑狼疮
- 所以
- 对称二苯代乙烯氧化
- 肿瘤坏死因子-α
- 肿瘤坏死因子α
- TPPU
- (1-trifluoromethoxyphenyl-3) - 1-propionypiperidin-4-yl尿素
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